β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用

摘要

目的 利用人工合成β2糖蛋白1（β2GP1）多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体, 并鉴定抗体的特异性及致病性。方法 应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽, 将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联, 免疫新西兰大白兔制备抗血清, 蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体, 利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞一定时间, 收集细胞总RNA和总蛋白, 实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子（TF）mRNA和蛋白表达; Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65（NF-κB p65）及磷酸化NF-κB p65表达情况; 体内实验采用C3H/HeN小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征（EAPS）模型, 检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间（APTT）。结果 化学合成β2GP1多肽的纯度为94％, 达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔, 其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带, 双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、 NF-κB p65磷酸化, 诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型, 小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200, APTT明显缩短。结论 所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子, 能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。