胰高血糖素衍生物在大肠杆菌的克隆表达和纯化

摘要

目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物.方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列,分段合成引物行:PCR扩增,以PCR扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和pET-30a质粒转化E.coli DH5α,获得重组质粒pET-G.将重组质粒pET-G转化至E.coli BL21(DE3),重组菌株命名为E. coli BL21[pET-G].以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行SDS-Tricine PAGE[十二烷基硫酸钠-三(羟甲基)甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析.对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱(HPLC)纯化后,行SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析,并以ELISA方法检测其免疫活性.结果 PCR扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致,重组质粒pET-G测序结果与预期完全一致.SDS-Tricine-PAGE和蛋白质印迹分析显示E. coli BL21(DE3)的表达产物相对分子质量与预期相符.经亲和层析纯化、凝血酶酶切和HPLC纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物,SDS-Tricine-PAGE分析显示其相对分子质量约为3500,飞行质谱分析相对分子质量为3531,二者基本一致.ELISA检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性.结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物,为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础.