体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体及其对人骨肉瘤细胞相应因子mRNA及蛋白的抑制

摘要

目的:设计并构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响.方法:实验于2006-01/07在青岛市市立医院试验中心完成.人骨肉瘤细胞系MG-63购自武汉大学生命科学院;pSilence2.1-neo载体带有U6启动子和neo基因(Ambin公司).①以人血管内皮生长因子的mRNA序列5'-GAT AAC GCG GAT ACC TTG G-3'为靶点,体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体pSilence2.1-neo-VEGF.②人骨肉瘤细胞MG-63常规培养,消化传代后分为3组:短发夹状RNA载体组转染pSilence2.1-neo-VEGF载体,空载体组转染pSilence2.1-neo载体,空白组无特殊处理.③转染后48 h收集各组细胞,采用RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达,免疫组化法检测血管内皮生长因子蛋白的表达.结果:①各组细胞血管内皮生长因子mRNA的表达情况:短发夹状RNA载体组VEGF165 mRNA的相对含量显著低于空白组、空载体组(0.181±0.010,1.064±0.019,1.052±0.036,P＜0.01),而空白组和空载体组之间差异无显著性意义.②各组细胞血管内皮生长因子蛋白的表达:空白组、空载体组多数细胞中出现明显的棕黄色颗粒状细胞质着色,而短发夹状RNA载体组细胞着色较淡.短发夹状RNA载体组的阳性细胞率显著低于空白组、空载体组[(20.12±2.63)%,(92.45±7.56)%,(91.76±5.26)%,P＜0.01],而空白组和空载体组之间差异无显著性意义.结论:pSilence2.1-neo-VEGF可显著抑制人骨肉瘤细胞MG-63血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达,为靶向血管的骨肉瘤基因治疗提供了参考依据.