重组降血压肽VLPVPR酶解制备工艺优化及降解原因分析

摘要

背景:采用基因工程技术与酶解法制备重组降血压肽VLPVPR,酶解产物为多肽混合物,易受微生物侵染而发生降解。目的:分析胰蛋白酶酶解制备重组降血压肽VLPVPR过程中影响VLPVPR稳定性的因素,并对酶解工艺进行了优化。方法:采用反相高效液相色谱法检测酶解产物中降血压肽VLPVPR的含量。工程菌表达产物经0.22μm膜过滤除菌,观察其酶解过程中降血压肽VLPVPR含量随时间的变化情况,与不过滤除菌酶解过程进行比较,探讨杂菌污染和工程菌自身蛋白水解酶对VLPVPR降解的影响。采用正交试验对温度、pH、酶浓度和时间等酶解工艺参数进行优化。结果与结论:降血压肽VLPVPR标准品与胰蛋白酶作用4h,含量基本不发生变化,差异无显著性意义(P>0.05),说明胰蛋白酶不能再进一步降解VLPVPR。经过过滤除菌后的细胞破碎上清液在酶解过程中的VLPVPR含量在达到最大后迅速降低,未经过滤除菌的样品中的降血压肽比过滤除菌的样品降解得更快,差异有显著性意义(P<0.05),表明工程菌释放的胞内酶和杂菌污染是导致VLPVPR降解的主要原因。通过正交试验优化了酶解制备重组降血压肽VLPVPR的最佳条件:温度30℃,pH9.5,胰蛋白酶终浓度180U/mL,酶解时间1h。