酶解猪血红蛋白制备降血压肽的工艺参数优化及体外降血压活性研究

摘要

猪血红蛋白经蛋白酶水解产生的具有降血压活性的多肽属于食源性生物活性肽，安全性高，研究报道其在降压功能方面具有较突出的表现，有望作为一种天然的降压组分获得广泛应用。
　　 本研究以血管紧张素转化酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)抑制率为指标，比较了不同蛋白酶水解猪血红蛋白得到的酶解产物的降血压活性（即ACE抑制活性），并根据酶解产物的降血压活性筛选一种最适水解用酶。以猪血红蛋白为底物，选用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶作为水解用酶，测定三种蛋白酶在各自适宜酶解条件下酶解猪血红蛋白产物的降血压活性及其水解度。研究结果表明，通过实验得到三种酶酶解6小时后，不同蛋白酶水解度由大到小依次为木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶，而ACE抑制率为胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。筛选出胰蛋白酶作为水解用酶来制备具有较高降血压活性的猪血红蛋白酶解产物。
　　 以胰蛋白酶作为水解用酶，采用底物浓度、水解温度、pH值、酶用量及水解时间等单因素实验对猪血红蛋白进行酶解，评价每个因素下的最佳酶解水平范围，并通过设计正交时间对酶解工艺参数进行优化，以获得具有较高降血压活性的酶解产物。研究结果表明，胰蛋白酶最佳酶解条件为底物浓度10％，水解温度40℃，pH值9.0，水解时间6h以及酶用量2000U/g，此时产物ACE抑制率为62.54％。
　　 以胰蛋白酶作为水解用酶，采用优化得到最佳酶解条件对猪血红蛋白酶解，将制备的酶解产物进行超滤分离，以考察不同分子量范围的酶解产物的降血压活性。研究结果表明各组分ACE抑制活性大小顺序为：Lc(分子量＜5KDa》＞Oc（酶解原液）＞Mc(10KDa＞分子量＞5KDa)＞Hc(分子量大于10KDa)，ACE抑制活性最强的组分为分子量小于5KDa的组分。
　　 将分子量小于5KDa的组分配制为4、8、12、16、20、24、28μg/mL7种浓度的溶液，卡普托利配制为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4.、2.8ng/mL7种浓度的溶液，并分别测定样品ACE抑制率。结果表明猪血红蛋白酶解产物分子量小于5KDa的组分的ACE抑制率活性IC50为13.69μg/mL，具有较强的体外降血压活性。对照样品IC50为符合报道中卡普托利IC50值，说明本实验酶解产物ACE抑制活性研究具有可行性，并且说明本实验测定样品ACE抑制率的方法具有科学性。
　　 配制胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶+胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶3种模拟胃肠道消化的环境，对未经超滤和已经超滤处理的两个组分进行进一步消化处理，考察酶解产物在消化酶的处理前后的变化，以其ACE抑制率作为评价指标判断其胃肠道消化稳定性。结果表明：分子量小于5KDa的组分在处理前后的ACE抑制率变化不明显。而酶解原液的猪血多肽在通过处理后，其ACE抑制活性都明显地降低。根据该结果评定出经胰蛋白酶酶解猪血红蛋白制备的降血压肽中分子量小于5KDa的组分具有高胃肠消化稳定性。
　　 本实验对猪血多肽作为降血压活性产品用于工业化生产奠定了实验基础，为今后开发猪血降血压活性肽提供了实验依据。同时也为猪血的深加工探索了新的途径。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 降血压肽

1.1.1 高血压与血管紧张素转换酶

1.1.2 食品蛋白质中的功能性多肽

1.1.3 血管紧张素抑制肽

1.1.4 ACEIP制备方法

1.1.5 ACEIP活性测定方法

1.2 猪血红蛋白

1.2.1 猪血的营养成分及应用

1.2.2 国内外猪血红蛋白开发现状

1.3 蛋白酶

1.3.1 蛋白酶的分类

1.3.2 蛋白酶的性质

1.4 研究目的及意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料、试剂及器具

2.1.1 实验材料及试剂

2.1.2 实验设备及用具

2.2 实验方法

2.2.1 猪血红蛋白的制备

2.2.2 猪血红蛋白降血压肽的制备与分级

2.2.3 相关指标测定方法

2.2.4 ACE抑制活性研究

2.2.5 模拟消化试验

2.2.6 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 猪血红蛋白液蛋白质含量

3.2 蛋白酶活力测定

3.2.1 标准酪蛋白曲线的绘制

3.2.2 蛋白酶的酶活力

3.3 蛋白酶筛选结果

3.3.1 不同蛋白酶的水解度

3.3.2 不同蛋白酶水解下的猪血红蛋白酶解产物的ACE抑制率

3.3.3 每种蛋白酶酶解产物的水解度与ACE抑制率

3.4 胰蛋白酶酶解猪血红蛋白的单因素实验结果

3.4.1 底物浓度对水解度与水解产物ACE抑制活性的影响

3.4.2 水解温度对水解度与水解产物ACE抑制活性的影响

3.4.3 pH对水解度与水解产物降血压活性的影响

3.4.4 酶用量对水解度与水解产物ACE抑制活性的影响

3.4.5 水解时间对水解度与水解产物ACE抑制活性的影响

3.5 最佳水解条件的优化

3.5.1 正交实验

3.5.2 极差分析

3.5.3 方差分析

3.5.4 各处理平均数多重比较(LSD)

3.6 分级组分的测定结果

3.6.1 蛋白质标准曲线的绘制

3.6.2 分级组分的蛋白质浓度及ACE抑制率

3.7 抑制活性的测定结果

3.8 模拟消化实验结果

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 关于猪血的前处理

4.1.2 关于猪血红蛋白的酶解

4.1.3 关于猪血红蛋白酶解产物的分级分离

4.1.4 关于猪血红蛋白制备的降血压肽的体外ACE抑制活性

4.1.5 关于猪血红蛋白酶酶解产物的脱色

4.2 结论

5 问题与展望

参考文献：

致谢