抗EpCAM+CD3双特异性抗体细胞生物学活性报告基因测定方法的建立和验证

摘要

目的:建立基于细胞的抗EpCAM+CD3双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)生物学活性报告基因测定方法(reporter gene assay,RGA).方法:构建稳定表达萤光素酶(luciferase,Luc)的HcT116-Luc细胞为靶细胞,以HuT78细胞为效应细胞,通过对样品浓度、孵育时间、细胞接种时间、效靶比和细胞接种密度进行优化建立报告基因法,根据人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)Q2指导原则和《中华人民共和国药典》(2015)指导原则,对RGA法的特异性、准确性、精密度、线性、代次稳定性和耐用性进行验证.结果:建立RGA方法经优化后的检测条件:效靶比为10:1;细胞接种密度为1.1 × 104细胞·孔-1;BsAb样品以3000ng·mL-1为起始浓度1:3.5向下稀释9个浓度梯度(共10个检测浓度);系列稀释样品与细胞孵育时间为72 h.孵育结束后测定Luc强度并以4-参数模式拟合剂量-效应曲线,计算样品相对生物学活性.建立RGA法的特异性、耐用性均符合应用要求.采用50％,70％,80％,100％,120％,130％,150％和200％共8个效价浓度进行准确性、精密度和线性验证,8个效价浓度的生物学活性回收率在95.48％～107.37％,变异系数(coefficient of variation,CV)在4.80％～9.97％,均＜10％,实测效价与理论效价线性回归分析相关系数r1＞0.99.第14～33代次HcT116-Luc细胞Luc表达情况稳定.结论:基于传代细胞建立的抗EpCAM+CD3 BsAb报告基因生物学活性测定方法操作简便,其特异性、精密度、准确性、耐用性方面符合应用要求,可作为此类双特异性抗体活性评价的方法,用于其质量控制中.