多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因

摘要

目的建立多重实时 PCR 检测志贺毒素（stx1、stx2）基因和紧密素基因（eae）的方法。方法优化多重实时 PCR 反应条件,检测系列稀释的阳性菌 DNA 提取物及纯化阳性质粒。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌株,并比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和 DNA提取方法,选出最适方法。同时用该方法对36份腹泻患者粪便标本进行直接检测且对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果多重实时 PCR 方法最低可以检测到10~1拷贝/μl的毒力基因和10~2CFU/μl的 DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌的阳性和阴性符合率均为100%。粪便样品的 DNA 提取以 BP 肉汤增菌6 h 后煮沸提取效果最好。36份腹泻患者粪便中2份eae 阳性,均鉴定为大肠埃希菌。结论建立的同时检测stx1、stx2、eae 基因的多重实时 PCR 方法,具有较高的敏感性,可用于产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。