TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

摘要

目的：利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ—RT—PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平，并进行疾病的活动性相关分析。方法：用Primer Express v2．0软件，根据GenBank提供的序列，在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA，加入已优化的一步法FQ—RT—PCR反应体系，扩增产物经凝胶电泳后切胶回收，并与pUCm—T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后，用T7RNA聚合酶转录为cRNA，作为FQ—RT—PCR系列浓度标准品。评价FQ—RT—PCR检测IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA—B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平，结合血浆可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)浓度，探讨与炎症活动的相互关系。结果：成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107cells／ml，其批内CV8．4％，批间CV9．6％；扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析，证实为IL-2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA—B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明：与正常人对照组结果比较，HLA—B27阳性组与HLA—B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0．01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96．7％。结论：FQ—RT—PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点；IL-2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态，可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。