太平洋牡蛎防御素在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性

摘要

防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,是软体动物抵御各种病原微生物侵染的重要免疫因子.太平洋牡蛎防御素(Crassostrea gigas defensin,CgD)近羧基端的43个氨基酸残基构成了其成熟肽区域,决定了CgD的生物学活性.首先通过逆转录PCR和设计特异性引物从太平洋牡蛎外套膜中分离并扩增到3'端添加和不添加6×His标签的两种目的基因CgDH+和CgDH-;与pPICZαA连接后构建的重组表达载体(pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-)电转至毕赤酵母Pichia pastoris X-33中,使用1.0％甲醇诱导表达目的蛋白CgDH+和CgDH-,最适培养条件为29℃、250 r/min、72 h;通过固化金属离子亲和层析(IMAC)获得分子量为5.78 kDa的纯化的重组蛋白CgDH+,根据其蛋白质浓度推算表达量为2.32 mg/Lo经MALDI-TOF-TOF质谱分析证明纯化产物即为预期的目的蛋白.抑菌试验结果显示分别含重组蛋白CgDH+和重组蛋白CgDH-的培养液上清对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa都具有抑菌活性,表明重组蛋白中6×His标签的存在与否并不影响其生物学活性.