牡蛎抗菌肽Molluscidin的密码子优化、重组毕赤酵母表达及抑菌活性

摘要

目的:利用重组毕赤酵母高效表达抑菌活性较好的牡蛎抗菌肽Molluscidin。方法:按照毕赤酵母密码子偏好性优化合成牡蛎抗菌肽Molluscidin,利用生物信息学方法分析其基本理化性质,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后与表达载体pPICZαA连接,构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,电转至毕赤酵母X-33,利用博来霉素抗性和PCR筛选阳性转化子,利用甲醇诱导表达并结合SDS-PAGE和Western blot分析验证,通过甲醇浓度和培养时间优化诱导表达条件,利用滤纸片琼脂扩散法测定培养上清的抑菌活性。结果:获得优化核酸序列,生物信息学分析显示Molluscidin的预期分子量为6521.87 Da,等电点为11.28,在酵母体内半衰期>20 h,理化性质较为稳定;成功构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,目的基因成功嵌入毕赤酵母,SDS-PAGE和Western blot验证获得1株高效表达的重组酵母,其优化表达条件为30℃、250 r/min、1.0%甲醇诱导表达48~72 h,滤纸片琼脂扩散法初步证明重组Molluscidin对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性。结论:筛选到1株重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CgMoCo,能高效表达抑菌活性较好的重组牡蛎抗菌肽Molluscidin,为其生产应用奠定了基础,也为重组贝类来源抗菌肽的开发利用提供了可资参考的技术途径。