NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定

摘要

构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性.根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域.设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒.转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证.鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白.利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定.克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19-393 aa)、NR1-S1(编码394-544 aa)和NR1-S2(编码663-800 aa).其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段.经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒pCold-SUMO-M1和pCold-SUMO-S 1-GT-S2.SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S 1-GT-S2蛋白.对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白.Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应.本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S 1-GT-S2纯化蛋白.该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测.