猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ-/Ampr突变株的构建

摘要

根据已发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清5型核苷酸序列设计并合成了一对引物,从自行分离的APP菌株PCR扩增apxⅡCA基因,将该片段与pBluescript SK(+)载体连接,得到质粒pSK-CA.另外,从质粒pIC-neo中得到的Ampr基因经XbaⅠ酶切消化后,克隆到pSK-CA中的XbaⅠ位点,获得了重组转移质粒pSK-CAmpr.pSK-CAmprDNA通过电转化导入亲本菌,电转化后的产物涂布于TM平板,可获得突变株.提取突变株和亲本菌基因组DNA,用PCR检测含有apxⅡC基因的胸膜肺炎放线杆菌染色体区域.从突变株基因组DNA扩增得到的一条PCR DNA片段比从亲本菌基因组DNA扩增得到的一条DNA片段大1.3 kb,增大的片段与所插入的Ampr基因大小相符合.用合成的Ampr基因引物从突变株基因组DNA中也能扩增到一条1.3 kb的特异性DNA片段.同时Southern blot鉴定有特异性带.这表明我们所构建的突变株是成功的.测定了突变株的遗传稳定性及突变株对动物的安全性,为进一步研究用其它报告基因置换Ampr基因后,研制单基因工程疫苗及以APP毒力缺失突变菌株为载体,表达外源基因的APP基因工程菌的研究奠定了坚实的基础.