化学合成siRNA对宫颈癌细胞SiHa中E6基因表达的抑制作用

摘要

背景与目的:宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(human papilloma virus)HPV16 E6、E7癌基因密切相关,人们曾采用核酶或E6、E7反义寡核苷酸抑制其表达,然而,上述两种方法存在费时、费力、抑制效率不高和维持时间短的问题.本研究拟探讨化学合成siRNA对HPV16阳性SiHa细胞E6基因表达的抑制作用以及对靶细胞的影响.方法:化学合成3条靶向HPV16 E6基因的siRNA,用脂质体法转染SiHa细胞,同时设立脂质体对照.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测siRNA作用后E6 mRNA水平的变化;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞技术(FCM)、免疫组化以及透射电镜技术(TEM)分别对细胞增殖活性、细胞周期、p53蛋白水平以及细胞超微结构的改变进行检测分析.结果:3条siRNA均能有效抑制E6 mRNA的转录表达,以siRNA1作用效果最为明显.MTT检测结果显示20、50和80 nmol/L终浓度转染后细胞增殖活性均有所下降,其中以50 nmol/L转染时增殖活性下降最明显.流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多,即表现为G1期阻滞,S期细胞的比例降低;免疫组化法检测对照组细胞P53蛋白灰度平均值为0.43±0.03,转染72 h后细胞p53蛋白灰度平均值为0.75±0.06,差异有显著性(P〈0.05);转染72 h后透射电镜下可见细胞细胞质浓缩,胞质中出现空泡.结论:化学合成siRNA可有效沉默SiHa细胞E6基因的转录表达,进而导致细胞生物学行为的改变.