慢病毒载体介导的Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响

摘要

目的 观察重组慢病毒载体介导Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响,同时探讨其可能的作用机制.方法 利用重组DNA技术将特异性shRNA序列插入慢病毒表达载体pGLV3.GFP中,形成pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA,将其转染至293T细胞中,随后进行病毒包装、滴度测定、转染率计算.采用实时荧光定量、Western blot测定转染肝星状细胞株(HSC-T6细胞)Nrt2 mRNA及蛋白的表达情况,利用Tunel染色法检测HSC-T6细胞的凋亡情况,同时对HSC-T6细胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平进行测定.结果 构建的重组病毒载体LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T细胞.激光共聚焦显示空白组细胞凋亡率低于A组和B组,与A组比较,B组的细胞凋亡率降低(P＜0.05).实时荧光定量PCR法结果显示空白组Nrf2 mRNA水平高于A组和B组(P＜0.05),与A组比较,B组mRNA水平升高(P＜0.05).Western blot法显示空白组Nrf2蛋白水平高于A组和B组(P＜0.05),与A组比较,B组蛋白水平升高(P＜0.05).与空白组相比,A组和B组PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表达量增加(P＜0.05),Bax蛋白减少(P＜0.05),其中A组PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白水平较B组增加(P＜0.05),Bax蛋白水平低于B组(P＜0.05).结论 Nrf2基因的shRNA慢病毒载体pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA在体外可抑制肝星状细胞活化,其作用机制可能与通过抑制PI3K-Akt通路促肝星状细胞凋亡有关.