慢病毒介导的星形胶质细胞升高基因-1表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis)是由于各种慢性肝病反复损伤导致的以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积为特征的病理生理过程，其病因主要包括病毒感染、非酒精或酒精性脂肪性肝炎、免疫损伤和胆汁淤积等。包括肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)在内的不同来源的肝脏肌成纤维细胞是此病理生理过程的主要驱动因素。
　　静态的HSCs富含维生素A，位于肝细胞及窦内皮细胞之间的狄氏间隙。肝脏受到损伤时，细胞内维生素A脂滴消失，静态HSCs转化为肌成纤维样细胞。这一转化过程对肝纤维化的发生、发展至关重要，称作静态HSCs的“激活”。活化的HSCs被赋予了多种能力，包括增殖速度加快、ECM分泌增加、迁移能力提高等。
　　目前，肝纤维化尚缺乏有效治疗手段。肝纤维化逆转需要纤维瘢痕降解消退，此基于胶原分泌细胞数量减少、能力弱化。已有研究证实活化的HSCs是最主要的促纤维化因素，因此，清除活化的HSCs、抑制其增殖、诱导凋亡、抑制其胶原分泌及迁移能力，是逆转肝纤维化的关键治疗靶点和重要策略。
　　星型胶质细胞升高基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)，也被称作异粘蛋白(metadherin，MTDH)，于2002年在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor, TNF-α)感染的星型胶质细胞中首次被发现。在过去的十余年间，对AEG-1的研究多集中在与肿瘤的关系上，包括乳腺癌、恶性胶质瘤、成神经细胞瘤及肝癌等。研究认为，AEG-1能够促进肿瘤的发生、发展，与肿瘤的预后密切相关，被认为是一种癌基因。例如，AEG-1在肝细胞癌中高表达，且表达量与癌症分期相关，表达越高则预后较差。近年来，随着国内外学者研究的不断深入，发现AEG-1的功能并非只是局限在肿瘤范围，在非肿瘤的生理、病理过程中也发挥着重要作用，如生长发育、炎症、神经退行性变等。这也促进人们对此基因功能谱的认识及内在机制的研究日益深入。
　　AEG-1可通过多条信号转导通路发挥作用，最重要的有磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/Akt、核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)等通路，而这些通路在肝纤维化发生、发展中均发挥重要作用。研究证明，在多种细胞中过表达AEG-1可促进细胞的增殖及侵袭、迁移能力，抑制其凋亡。更重要的是，上调AEG-1能促进细胞的炎症反应及血管新生能力，而这些也是肝纤维化形成的关键因素。但迄今为止，AEG-1与肝纤维化及HSCs之间的关系尚无报道。
　　本课题旨在研究AEG-1在肝纤维化形成及活化HSCs中的表达，应用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术下调AEG-1表达后，观察其对HSCs细胞活化、凋亡和迁移等生物学行为的影响，并进一步研究导致此些影响所涉及的信号转导通路。本学位论文由以下四部分组成:
　　第一部分、星形胶质细胞升高基因-1在肝纤维化大鼠肝组织及活化HSCs中的表达
　　目的:研究AEG-1在大鼠纤维化肝脏及促纤维化因子刺激后HSCs中的表达。
　　方法:应用胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)及二甲基亚硝胺(dimethyl-nitrosamine，DMN)腹腔注射两种方法建立大鼠肝纤维化模型。BDL模型组结扎胆总管，假手术组只分离胆总管不结扎，均于术后2wk取材。DMN模型组腹腔注射1％DMN，每周连续3d，对照组腹腔注射生理盐水，均于4 wk后取材。肝组织石蜡切片经HE与天狼星红染色(Sirius Red)检测肝脏病理变化。免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)观察AEG-1的表达及定位。Western blot及RT-real time PCR检测AEG-1蛋白及mRNA的表达。采用原位灌流、梯度密度离心技术分离大鼠原代HSCs，倒置荧光显微镜观察刚分离静止的大鼠原代HSCs，应用免疫细胞化学染色技术检测α-SMA表达以鉴定活化的大鼠原代HSCs。应用细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS∶0μg/ml，0.5μg/ml，1.5μg/ml)及转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β∶0 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml)刺激HSC-T624 h，应用LPS(1.5μg/ml)或TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6或原代大鼠HSCs0 h，24 h或48 h，Western blot检测干预前后AEG-1蛋白的表达变化。
　　结果:
　　①HE与天狼星红染色结果证明BDL和DMN诱导的大鼠肝纤维化模型成功建立。BDL诱导的纤维化模型可见肝脏结构紊乱，大量胶原沉积，胆管明显扩张和增生;DMN诱导的肝纤维化模型除肝脏结构紊乱外，尚可见明显的出血性坏死、肝窦充血及大量炎细胞浸润。
　　②免疫组织化学法染色显示，BDL及DMN诱导的肝纤维化大鼠肝脏细胞AEG-1表达明显升高，主要定位于细胞质，而对照组基本无表达。
　　③Western blot及RT-real time-PCR检测显示，BDL及DMN模型组较对照组AEG-1均明显升高(P＜0.05）。
　　④TGF-β(0 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml)刺激HSC-T624 h，5 ng/ml刺激组AEG-1蛋白水平无明显升高，10 ng/ml组AEG-1蛋白水平明显升高。应用10 ng/ml TGF-β刺激HSC-T624 h及48 h，结果显示，48 h刺激组较24 h组AEG-1蛋白水平进一步升高(P＜0.05）。
　　⑤LPS(0μg/ml,0.5μg/ml,1.5μg/ml)刺激HSC-T624 h,0.5μg/ml刺激组AEG-1蛋白水平无明显升高，1.5μg/ml组AEG-1蛋白水平明显升高。应用1.5μg/ml LPS刺激HSC-T624 h及48 h，结果显示，48 h刺激组较24 h组AEG-1蛋白水平进一步升高（P＜0.05）。
　　⑥采用肝脏原位灌注链酶和胶原酶，以Nycodenz为介质，密度梯度离心一步法成功分离出大鼠原代HSCs。细胞得率为1.0×107至1.5×107/只，细胞存活率和纯度均大于90％。在倒置显微镜下观察刚分离的HSCs呈圆形，胞浆中富含脂滴，在波长328 nm的荧光显微镜下观察，刚分离的原代HSCs呈自发蓝色荧光。培养至14d，大鼠HSCs呈活化状态，脂滴消失，变成梭形肌成纤维样细胞。
　　⑦原代HSCs性质鉴定。刚分离的HSCs免疫细胞化学染色α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达阴性;原代培养14 d后α-SMA阳性染色率达100％。
　　⑧应用10 ng/mlTGF-β及1.5μg/ml LPS刺激原代大鼠HSCs24 h及48 h，刺激24 h组AEG-1蛋白表达无明显升高，刺激48 h组AEG-1蛋白表达则明显升高(P＜0.05）。
　　结论:AEG-1在大鼠BDL及DMN诱导的肝纤维化组织中明显升高。TGF-β及LPS刺激HSC-T6及原代大鼠HSCs可使AEG-1表达升高，且呈时间、剂量依赖性。
　　第二部分、星形胶质细胞升高基因-1表达下调对肝星状细胞活化的影响
　　目的:构建慢病毒介导的短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)下调AEG-1的表达，观察其对HSC-T6细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响。
　　方法:设计并合成可抑制AEG-1表达的shRNA，根据转染率摸索出适合靶细胞的感染复数(multiplicity of infection，MOI)，转染进入HSC-T6细胞中。利用westem blot和RT-real-time PCR方法检测AEG-1蛋白和mRNA表达情况，筛选出一条抑制效率最高的shRNA。成功下调HSC-T6的AEG-1表达后，CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞增殖;流式细胞学分析细胞周期变化;western blot和RT-real time PCR方法检测Ⅰ型胶原及α-SMA水平的变化。
　　结果:
　　①通过预实验摸索出MOI值为20。转染进入细胞后，根据蛋白及mRNA检测结果，所设计的3条shRNA质粒片段均可显著抑制AEG-1蛋白及基因的表达，蛋白干扰的效果分别达到75.22％、60.21％及64.36％，mRNA表达分别下降85.52％、69.96％及71.10％，与空白对照组相比均有显著性差异(P＜0.05）。
　　②下调AEG-1表达促进了HSC-T6细胞增殖，培养24 h，Lenti-shAEG-1组(1.13±0.13)较Lenti-shCon组(1.57±0.22)明显下降(P＜0.05）。培养48 h，Lenti-shAEG-1组(1.49±0.19)较Lenti-shCon组(2.12±0.24)进一步下降(P＜0.01）。Lenti-shCon组与uninfected组相比均无明显变化。
　　③流式细胞学检测下调AEG-1表达可影响HSC-T6的细胞周期。Lenti-shAEG-1组(48.67±4.35％)较Lenti-shCon组(29.70±3.08％) G0/G1期细胞比例上升(P＜0.05），而G2/M期细胞比例下降(4.90±1.71 vs15.07±3.37，P＜0.05)，表明细胞被阻滞在G0/G1期。
　　④下调AEG-1后，HSC-T6的α-SMA的蛋白(0.31±0.11 vs0.78±0.12，P＜0.05)及mRNA(0.57±0.27 vs1.14±0.23，P＜0.05)水平较阴性对照组分别下降了60.32％及41.34％。
　　⑤Ⅰ型胶原蛋白(0.36±0.12 vs0.73±0.23，P＜0.05)及mRNA(0.57±0.11 vs0.99±0.11，P＜0.05)水平较阴性对照组分别下降了50.72％及42.54％。而两者的阴性对照组较未感染组无明显变化。
　　结论:成功构建靶向AEG-1的shRNA并下调AEG-1表达。下调AEG-1表达可抑制HSC-T6的活化。
　　第三部分、星形胶质细胞升高基因-1表达下调诱导肝星状细胞凋亡、抑制迁移
　　目的:观察shRNA下调AEG-1表达后对HSC-T6细胞的凋亡和迁移的影响。
　　方法:下调HSC-T6的AEG-1表达后，膜联蛋白(Annexin(Ⅴ))/藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)联合标记流式细胞术检测HSCs凋亡率;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(terminaldeoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL)检测HSC-T6凋亡;扫描电镜观察细胞形态;RT-Real time PCR测定caspase-3 mRNA的表达;划痕实验及Transwell小室检测细胞迁移。
　　结果:
　　①下调AEG-1后，HSC-T6的TUNEL染色阳性细胞率较对照组提高了1.93倍（P＜0.05）。
　　②流式细胞技术检测显示，下调AEG-1表达后，Lenti-shAEG-1组细胞凋亡率(27.12±5.72％)较Lenti-shCon组（8.88±3.20％）及uninfected(7.97±2.52％)组明显升高(P＜0.01）。
　　③AEG-1shRNA干扰HSC-T6细胞后，与阴性对照组相比，细胞体积缩小，细胞表面微绒毛缩短，伪足缩短或消失。
　　④下调AEG-1升高了Caspase-3的mRNA表达，Lenti-shAEG-1组较Lenti-shCon组升高了1.86倍(P＜0.05)。
　　⑤划痕愈合实验:划痕后培养24 h，Lenti-shAEG-1组划痕愈合率(0.41±0.06)较Lenti-shCon组(0.56±0.05)下降26.8％(P＜0.05)。培养48 h后，划痕愈合率Lenti-shAEG-1组(0.59±0.13)较Lenti-shCon组(0.88±0.12)下降33.7％(P＜0.05)。
　　⑥Transwell assay实验:Tanswell小室中接种细胞后，细胞培养箱培养24 h，结果显示，Lenti-shAEG-1组细胞迁移数(18.20±3.44)较Lenti-shCon组(46.60±4.85，P＜0.05)降低了71.21％。
　　结论:下调AEG-1表达后，可以促进HSC-T6的凋亡，抑制其迁移。
　　第四部分、星形胶质细胞升高基因-1调控肝星状细胞生物学行为的信号转导机制
　　目的:研究慢病毒介导shRNA下调AEG-1表达对HSC-T6细胞内PI3K/Akt、ERK及P38 MAPK信号转导通路的调节作用。
　　方法:慢病毒介导的shRNA下调HSC-T6的AEG-1表达后，Westernblot检测PI3K/Akt及ERK、P38 MAPK磷酸化及总蛋白活化表达情况。
　　结果:
　　①下调AEG-1表达可以抑制PI3K、Akt水平，而对总蛋白无明显影响。ShAEG-1组与shCON组比较，p-PI3K/PI3K、p-AktThr308/Akt和p-AktSer473/Akt明显下调（P＜0.05）。
　　②下调AEG-1表达可以抑制ERK、P38 MAPK水平，而对总蛋白无明显影响。ShAEG-1组与shCON组比较，p-ERK/ERK和p-P38/P38明显下调（P＜0.05）。
　　结论:下调AEG-1表达对HSC-T6生物学行为的调控可能是通过抑制PI3K/Akt及ERK、P38的磷酸化实现的。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 星形胶质细胞升高基因-1在肝纤维化大鼠肝组织及活化肝星状细胞中的表达

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 星形胶质细胞升高基因-1表达下调抑制肝星状细胞活化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 星形胶质细胞升高基因-1表达下调诱导肝星状细胞凋亡、抑制迁移

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 星形胶质细胞升高基因-1表达下调对肝星状细胞生物学行为影响的信号转导机制

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

结论

综述一 肝星状细胞与慢性肝病

综述二 AEG-1功能及与消化系统疾病的关系

致谢

个人简历