猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究

摘要

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增.将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2.经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2.经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增.PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达.结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2.3次噬斑试验纯化重组腺病毒.测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL.将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平.小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础.