猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

摘要

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的ORF2基因与T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础.以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头(Gly4 Ser)3为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子(Gly4 Ser)3进行融合连接.将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMVORF2-TCE,将该重组质粒用Pme Ⅰ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞(内含pAdEasy-1骨架质粒)进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE.Pac Ⅰ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为10123TCID50/mL.Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorecent assay,IFA)结果表明融合蛋白得到正确表达.