猪圆环病毒2型ORF2基因及ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠免疫效果的研究

摘要

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜单股环状DNA病毒，是迄今已知最小的动物病毒之一。根据PCV的抗原性和基因组成不同，将其分成两种不同的基因型即PCV1和PCV2。PCV1无致病性，但广泛存在于猪体内及部分猪源传代细胞系；PCV2具有致病性，可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post- weaning multisystemic wasting syndrom，PMWS)。 PCV2基因组含有11个开放阅读框(ORF)，其中ORFl编码病毒复制相关蛋白(Rep)，ORF2编码病毒的主要结构蛋白(Cap)，具有病毒的主要的抗原中和表位。本研究在实验室前期研究的基础上，将冻存的重组腺病毒重新培养后，对其进行PCR、酶切、测序和 Western-blot鉴定。然后将重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORFl-2和Ad-ORFl、Ad-ORF2混合毒以及空载体腺病毒Ad-C、PBS分别免疫6周龄Balb/c小鼠，在初次免疫后的第2周和第4周分别加强免疫一次。第三次免疫后两周每组分别取5只小鼠，眼球采血后处死。在无菌条件下，取脾脏分离淋巴细胞，测定脾细胞中Th、Tc和B细胞亚群的含量以及脾淋巴细胞的增殖能力、NK细胞的自然杀伤活性、CTL的特异性杀伤活性。同时测定各组小鼠血清的PCV2 ORF2特异性抗体。实验结果如下： 1.将实验室前期构建的重组腺病毒重新培养后经PCR、酶切和测序鉴定，证实目的基因插入正确，无丢失和变异现象发生；荧光显微镜观察和Western-blot检测显示，重组腺病毒能稳定表达目的蛋白，而且目的蛋白能被PCV2感染猪的阳性血清所识别。 2.重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2和Ad-ORF1、Ad-ORF2混合病毒经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后，随着免疫次数的增加小鼠产生的针对PCV2 ORF2基因的特异性抗体水平不断升高，第3次免疫后2周达到最高，但第3次免疫后4周有所下降；与对照组相比，各实验组都能够引起小鼠脾细胞中Th、Tc亚群含量的增加，但B淋巴细胞的百分含量无明显变化，实验组间Th和Tc亚群的百分含量无显著差异(P>0.05)：脾淋巴细胞增殖实验表明，试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力与对照组比较均有显著的差异，但实验组间脾淋巴细胞的增值能力无显著差别(P>0.05)；NK细胞自然杀伤活性实验显示，试验组小鼠的NK细胞自然杀伤活性对照组比较均有显著的差异，Ad-ORF2组和Ad-ORF1+Ad-ORF2组小鼠的NK细胞自然杀伤活性高于Ad-ORF1+2组(P<0.01)，Ad-ORF2组和Ad-ORF1+Ad-ORF2组小鼠的NK细胞自然杀伤活性差异不显著(P>0.05)；CTL杀伤活性实验表明，试验组小鼠的CTL杀伤活性与对照组比较均有显著的差异，Ad-ORF1+Ad-ORF2组小鼠的CTL杀伤活性最高，Ad-ORF2组小鼠的CTL杀伤活性(P<0.01)最低。本研究以Balb/小鼠为实验动物模型，对重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2及Ad-ORF1+Ad-ORF2混合毒的免疫效果进行了研究，结果表明，重组腺病毒均能在小鼠体内诱导较强的PCV2全面免疫应答反应，包括体液免疫应答反应和细胞免疫应答反应。这些实验结果不仅为进一步的猪体实验提供了参考，还为我国PCV2基因工程活载体疫苗的深入研究及应用提供了物质基础。

目录

文摘

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论文说明：缩略词

声明

第一章猪圆环病毒研究进展

1.1 PCV的发现和命名

1.2 PCV的病毒学分类

1.3 PCV的形态学特性与理化特性

1.4 PCV的培养特性

1.5 PCV的基因组

1.6 PCV的复制与转录

1.7 PCV的主要结构蛋白

1.7.1 Rep蛋白

1.7.2 Cap蛋白

1.8 PCV2的致病机理

1.9 PCV2的流行病学

1.9.1宿主

1.9.2传播途径

1.9.3传染源

1.10 PCV2感染的临床症状与病变

1.10.1临床症状

1.10.2病理变化

1.11 PCV2感染的诊断

1.11.1病毒分离

1.11.2电镜技术

1.11.3间接免疫荧光试验(IFA)

1.11.4免疫细胞化学(ICC)及原位杂交技术(ISH)

1.11.5抗原捕获ELISA

1.11.6聚合酶链式反应(PCR)

1.11.7常规PCR

1.11.8复合PCR(mPCR)

1.11.9套式PCR(nPCR)

1.11.10竞争PCR(cPCR)

1.11.11 PCR产物限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)

1.11.12免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)

1.11.13酶联免疫吸附试验(ELISA)

1.12 PCV2疫苗及免疫防治

1.12.1减弱活毒苗

1.12.2弱病毒活疫苗

1.12.3 DNA疫苗

1.12.4基因工程疫苗

第二章基因工程疫苗研究进展

2.1基因工程亚单位疫苗

2.1.1细菌性疫病亚单位疫苗

2.1.2病毒性疫病亚单位疫苗

2.1.3激素亚单位疫苗

2.2基因工程活载体疫苗

2.2.1基因突变疫苗及基因缺失疫苗

2.2.2病毒活载体重组疫苗

2.2.3细菌活载体重组疫苗

2.3核酸疫苗

2.4合成肽疫苗(synthetic peptide vaccines)

2.5转基因植物疫苗

2.6本研究的目的和意义

第三章重组腺病毒的培养、鉴定及活力测定

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1重组腺病毒和空载腺病毒病毒液的荧光检测

3.2.2 PCR反应扩增的ORF1和ORF2基因及酶切电泳

3.2.3重组质粒的序列分析

3.2.4重组腺病毒表达PCV2 ORF1和ORF2基因的Western-blot图

3.2.5重组腺病毒及空载腺病毒TCID50值

3.3讨论

3.4小结

第四章PCV2 ORF2基因及ORF1-2串联基因重组腺病毒的免疫效果

4.1实验材料

4.1.1细胞和毒株

4.1.2实验动物

4.1.3主要试剂及培养基

4.1.4主要实验仪器

4.2实验方法

4.2.1细胞免疫检测试剂

4.2.2 ELISA用试剂

4.2.3实验动物的免疫

4.2.4 PCV2 ORF2特异性抗体的测定

4.2.5脾淋巴细胞的制备

4.2.6脾淋巴细胞增殖能力的测定(MTT法)

4.2.7 NK细胞自然杀伤活性检测

4.2.8 CTL杀伤活性的测定

4.2.9脾淋巴细胞亚群含量的检测

4.2.10统计学分析

4.3实验结果及分析

4.3.1 PCV2 ORF2抗体检测结果

4.3.2脾淋巴细胞增殖能力的测定

4.3.3 NK细胞杀伤活性测

4.3.4 CTL杀伤活性测定

4.3.5脾淋巴细胞亚群含量的检测

4.4讨论

4.5小结

结论

参考文献

致谢

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