含TK-IES-ES非融合基因重组腺相关病毒的构建及其功能的初步鉴定

摘要

目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-内皮抑素(ES)(简称rAAV-TIE)非融合载体的构建及每个目的 基因相应生物学效应的初步鉴定.方法 (1)用PER分别扩增IRES、TK、ES序列至pMD-19T simple载体,构建pAAV-TK-IRES-ES;(2)分别采用从V-Helper Free System包装系统、"氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩.(3)用T24细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对rAAV-TIE生物学效应进行初步鉴定.结果(1)成功构建pAAV-TIE非融合载体,并经酶切、PCR及测序证实;(2)rAAV病毒颗粒滴度达2×1010v.p/mL,浓缩后可达到2×1011-12 v.p/mL;(3)rAAV-TIE可以分泌内皮抑素,诱导T24细胞及HUVEC凋亡.结论 成功构建rAAV-TIE腺相关病毒,体外实验表明每个基因片段均能发挥相应的生物学功能.