腺相关病毒

摘要： 目的 探究通过化学遗传特定药物激活受体(designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs)抑制下丘脑室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)谷氨酸能神经元兴奋性对小鼠心肌缺血/再灌注损伤(ische-mia reperfusion,IR)的影响.方法 建立小鼠PVN置管模型单笼饲养3 d后,PVN注射抑制病毒rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP或对照病毒rAAV-CaMKⅡα-EGFP.病毒感染3周后,建立小鼠IR模型.通过术前1 h腹腔注射氯氮平-N氧化物,诱导PVN谷氨酸能神经元抑制.测定心肌梗死面积、血清cTnI浓度,监测小鼠心电图,检测心肌内ERK、cleaved caspase-3水平,观察PVN内EGFP、CaMKⅡ和c-Fos表达.结果 与Sham组相比,IR组IS/AAR增大,血清cTnI浓度升高,PVN内c-fos表达增加,心肌组织cleaved caspase-3表达增加,pERK水平降低.然而,hM4D(Gi)DREADD介导的PVN谷氨酸能神经元抑制可明显减少IS/AAR,降低cTnI浓度,抑制PVN内c-fos表达,并降低心肌cleaved caspase-3表达,升高pERK水平.结论 通过化学遗传术DREADD抑制PVN谷氨酸能神经元兴奋性可减轻小鼠IR损伤.

摘要： 目的观察整合素连接激酶-小干扰RNA-特异性腺相关病毒(ILK-siRNA-AAV)对大鼠青光眼滤过术后滤过通道瘢痕形成的抑制作用。方法选取SPF级8~9周龄SD大鼠48只,采用随机数表法将其分为空白对照组、ILK-siRNA-AAV组、NC-siRNA-AAV组和丝裂霉素C(MMC)组,每组12只。每只大鼠均取左眼为实验眼,右眼不做特殊处理。采用前房植入引流管法建立大鼠青光眼滤过术球结膜滤过泡模型,空白对照组、ILK-siRNA-AAV组和NC-siRNA-AAV组术后1 d滤过泡内分别注入磷酸盐缓冲液、ILK-siRNA-AAV和NC-siRNA-AAV各5μl,MMC组术中采用含0.4 mg/ml MMC的小棉片置于结膜瓣下5 min。术前及术后1、2、3、7、14、21、28 d,采用手持式眼压计测量术眼眼压;术后1、2、3、7、14、21、28 d,采用手术显微镜观察术眼滤过泡形成情况,采用Kaplan-Meier生存分析计算滤过泡生存天数;术后28 d,采用逆转录PCR及Western blot法检测术区结膜及结膜下组织中ILK的mRNA及蛋白表达,检测ILK基因沉默效应;采用苏木精-伊红染色观察ILK基因沉默对滤过通道组织形态的影响;采用Masson染色观察ILK基因沉默对球结膜滤过泡术区组织胶原纤维沉积作用,计算胶原纤维染色阳性面积占整个组织视野面积的百分比。结果各组大鼠手术前后不同时间点眼压总体比较,差异均有统计学意义(F_(分组)=76.84,P<0.001;F_(时间)=114.49,P<0.001),其中ILK-siRNA-AAV组术后第1、7、14和28天眼压均低于空白对照组,MMC组术后第2、3、7、14和28天眼压均低于空白对照组,ILK-siRNA-AAV组术后第7、14、21和28天眼压均低于NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,空白对照组、NC-siRNA-AAV组、ILK-siRNA-AAV组和MMC组滤过泡生存天数分别为(3.50±1.51)、(5.00±3.41)、(31.50±3.15)和(31.33±2.46)d,总体比较差异有统计学意义(F=395.83,P<0.05),其中ILK-siRNA-AAV组和MMC组滤过泡生存天数均多于空白对照组和NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组ILK mRNA及蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=222.32、752.69,均P<0.05),其中ILK-siRNA-AAV组ILK mRNA及蛋白相对表达量明显低于空白对照组和NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示,空白对照组和NC-siRNA-AAV组术区纤维结缔组织增生,细胞大量增生,成纤维细胞密度高,呈团块状生长;ILK-siRNA-AAV组球结膜较薄,纤维结缔组织排列疏松,少量成纤维细胞增生;MMC组结膜纤维层疏松、菲薄,形成空洞,细胞稀少。各组胶原纤维染色阳性面积百分比总体比较差异有统计学意义(F=741.66,P<0.05),其中与空白对照组比较,ILK-siRNA-AAV组和MMC组阳性染色百分比显著降低,ILK-siRNA-AAV组阳性染色百分比明显低于NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论ILK-siRNA-AAV沉默ILK表达可抑制大鼠滤过术后滤过区组织瘢痕形成,降低眼压。

摘要： 目的构建稳定表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因重组腺相关病毒过表达质粒载体,制备并纯化HGF过表达的高滴度重组腺相关病毒。方法合成HGF基因并利用PCR扩增,退火形成双链,与pAAV-ITR-CMV质粒经XhoⅠ单酶切连接构建质粒pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF,转化至大肠杆菌DH5α,提质粒后经酶切和测序鉴定证实重组质粒克隆正确,将重组质粒转染至293FT细胞中包装为腺相关病毒。小鼠注射病毒后通过Western blot法评价HGF的蛋白表达水平。结果扩增产物包含HGF CDS全序列的2186 bp,酶切结果与测序结果说明PCR扩增HGF目的片段成功;实时荧光定量PCR检测结果显示,纯化后所得的过表达HGF的腺相关病毒滴度为5.22×10^(12) vg·mL^(-1);HGF过表达组HGF蛋白相对表达含量较生理盐水组与阴性对照组均升高(P均<0.01)。结论本研究成功构建了HGF腺相关病毒载体且病毒滴度达到普通动物注射要求,证明腺相关病毒载体构建成功。

摘要： 旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Western blot分析其对S基因表达的抑制作用,筛选出抑制效率最高的shRNA1;构建包装表达shRNA1的重组腺相关病毒(rAAV)载体,将rAAV-shRNA1与S基因表达质粒共同转导293T细胞,S基因表达的抑制率为65.6%;两者通过滴鼻或肌肉注射方式共同转导小鼠,qRT-PCR检测其在体内对S基因表达的抑制率分别为36.8%和90.3%。

摘要： 目的探索腺相关病毒载体Anc80L65对正常和不同程度损伤的成年小鼠椭圆囊前庭感觉上皮的转染特性。方法将6周龄小鼠分为以下三组。1)正常对照组:将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的Anc80L65病毒液(Anc80L65-GFP),经后半规管注射途径导入小鼠内耳;2)中度损伤组:行水平半规管注射导入150μg链霉素,术后2周通过后半规管注射导入Anc80L65-GFP病毒液;3)重度损伤组:行水平半规管注射导入400μg链霉素,术后2周行后半规管注射导入Anc80L65-GFP病毒液。导入病毒后4周取椭圆囊行免疫荧光染色,观察椭圆囊的形态及GFP在椭圆囊感觉上皮的表达情况。结果正常对照组:Anc80L65-GFP病毒液注射后,正常椭圆囊毛细胞无明显缺失,纤毛形态正常,GFP广泛分布于整个感觉上皮区域。中度损伤组:椭圆囊前庭毛细胞数量明显减少,支持细胞仍存活,GFP广泛分布于整个感觉上皮区域。高倍镜下见前庭支持细胞和毛细胞被转染。重度损伤组:椭圆囊的前庭毛细胞和支持细胞均被损伤,前庭感觉上皮演化为细胞大小不一、形态不规则的扁平上皮结构。在前庭扁平上皮中,GFP阳性细胞数量与对照组及中度损伤组相比明显减少。结论Anc80L65能高效转染正常和中度损伤后的成年小鼠椭圆囊前庭感觉上皮,但对重度损伤后形成的前庭扁平上皮的转染效率较低,这可能与其细胞属性发生改变有关。在未来的前庭基因治疗研究中,须根据前庭感觉上皮的不同损伤程度来选择合适的载体。

摘要： 目的探讨siRNA沉默COX-2基因表达对大鼠创伤性深静脉血栓形成(TDVT)的影响及可能的分子机制,期望能为TDVT的治疗新方向提供有力的证据支持。方法将构建好的COX-2siRNA-AAV表达载体溶液由尾静脉注入造模成功的大鼠体内设为COX-2干扰组,并设置生理盐水组、低分子肝素组、阴性对照组以及未造模的正常对照组,每组6只大鼠。饲养5 d后取材,通过HE染色、ELISA、RT-PCR以及Western Blot检测相应指标。结果COX-2干扰组血栓形成率下降,ELISA、RT-PCR及Western Blot检测结果发现,COX-2干扰组的COX-2的蛋白表达量及mRNA的表达水平降低(P<0.001)。结论COX-2siRNA可以通过调节COX-2基因的表达来降低大鼠TDVT的形成,同时提示COX-2可以作为TDVT治疗的一个重要靶点。

摘要： 通过在AAV5衣壳的N573后插入一个寡肽PGPSPAD生成了一种改良的AAV血清型,称为AAVc1,它在体外和体内均表现出比AAV5、AAV8和AAV9更好的肌肉感染性;恒河猴血清中针对AAVc1的中和抗体(Neutralizing antibodies,Nabs)滴度低于AAV9,这表明针对AAVc1的中和抗体的免疫应答低于AAV9。结果表明,新型血清型AAVc1应用到AAV基因治疗中优于野生型AAV血清型。

摘要： 肝脏是人体内最大的实质器官,负责机体的代谢解毒,具有较强的再生能力,在重度损伤条件下胆管细胞能够转分化为肝实质细胞,以补充损伤的肝实质细胞,但是具体机制尚不清楚。胆管类器官在体外可长期扩增并保持向肝实质细胞分化的潜能,同时利用腺相关病毒AAV载体可实现胆管类器官高效基因操纵。我们结合AAV介导的基因操纵与胆管类器官分化模型,探究了转录因子HMGA2及CEBPD在肝脏细胞谱系转化过程中的重要功能。研究结果发现过表达HMGA2能够抑制胆管细胞向肝实质细胞的分化,而过表达CEBPD可以促进胆管细胞向肝实质细胞分化。我们的工作揭示了HMGA2和CEBPD作为新的转录调节因子,可能参与胆管细胞的谱系维持以及肝实质细胞的分化。

摘要： 目的原核表达和纯化腺相关病毒(AAV)衣壳保守区抗原肽,制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA,将序列克隆到载体pET30a,获得质粒pET30a-AAV-CR,原核表达并纯化保守区多价抗原肽,考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组(1只/组),实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体,对照组注射PBS,ELISA检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR,表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质;纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体,且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体,为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。

摘要： 目的·探究腺相关病毒血清型8型(adeno-associated virus serotype 8,AAV8)介导的野生型缝隙连接蛋白β2(gap junction proteinβ2,Gjb2)基因在Gjb2基因c.109G>A纯合突变小鼠(简称Gjb2纯合突变小鼠)耳蜗支持细胞区域的表达情况及安全性,以及对呋塞米引起的听力下降的影响。方法·将带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的AAV8-GFP病毒,经耳蜗中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠的内耳,注射14 d后取小鼠耳蜗,荧光显微镜观察基底膜GFP的表达情况。将载有野生型Gjb2基因的AAV8-GJB2-GFP病毒经中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠内耳后,于4周后通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测耳蜗Gjb2 mRNA及其编码的连接子蛋白(connexin 26,CX26)的表达水平,通过免疫荧光法观察其具体表达位置。通过听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)实验评价新生纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-GFP后4周龄时5.66~45.00 kHz的听力阈值。采用呋塞米试验比较野生型小鼠及Gjb2纯合突变小鼠腹腔注射呋塞米前后的ABR阈值变化,以及观察Gjb2纯合突变小鼠经AAV8-GJB2-GFP治疗后能否缓解呋塞米导致的听力下降。结果·AAV8-GFP注射14 d后耳蜗顶圈、中圈、底圈支持细胞的转染率分别为(11.60±1.28)%、(10.33±1.55)%、(5.40±0.86)%。AAV8-GJB2-GFP注射4周后耳蜗Gjb2 mRNA水平约为未注射耳的1.26倍(P=0.014),CX26蛋白水平是未注射耳的1.31倍(P=0.001);注射后通过荧光显微镜观察到耳蜗支持细胞表达CX26,内毛细胞区域也有CX26异位表达。ABR检测显示,给药耳各频率听力阈值与对侧耳无明显差异,表明其安全性较好。Gjb2纯合突变小鼠经呋塞米诱导后较野生型小鼠产生更明显的听力阈移,注射AAV8-GJB2-GFP 4周后突变小鼠阈移小于未治疗小鼠,在8.00、11.32、16.00 kHz测得的阈值,2组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论·在新生Gjb2纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-GFP,可使小鼠成年后耳蜗支持细胞表达外源性Gjb2,挽救呋塞米诱导的听力下降。

摘要： 目的：探讨重组腺相关病毒介导VEGF和BMP双基因共表达对兔早期激素性股骨头坏死的修复作用.方法：制备rAAV-IRES-hrGFP(AAV-GFP)、rAAV-hVEGF 165-IRES-hrGFP(AAV-VEGF)、rAAV-hBMP-7-IRES-hrGFP(AAV-BMP)及rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7(AAV-VEGF/BMP)四种重组腺相关病毒载体.以细菌脂多糖联合甲基强地松龙注射制备兔早期SANFH模型,通过MRI影像学检测行SANFH模型的筛选;通过髓芯减压手术分别将四组重组腺相关病毒载体以25μL/侧剂量直接注射入各组髓芯减压遗留的骨缺损区内.病毒注射后12w分别应用Western blot检测及免疫组织化学染色检测股骨头hVEGF165及hBMP-7目的蛋白的表达;通过股骨头MRI影像学检测、股骨头核素扫描组织代谢检测、股骨头组织病理学检测、股骨头血管墨汁灌注冰冻切片检测、Micro-CT股骨头骨矿物质密度检测及股骨头生物力学强度检测等方法综合评估重组腺相关病毒载体对兔早期SANFH的修复作用.结果：早期兔SANFH模型可见典型的早期骨坏死表现,成模率可达73.33％;病毒注射12w后,rAAV-hVEGF 165-IRES-hBMP-7重组腺相关病毒载体有效表达hVEGF165及hBMP-7基因并产生hVEGF165及hBMP-7目的蛋白;体内表达的hVEGF165目的蛋白通过增加股骨头内新生血管数量,改善股骨头内血供,促进了骨坏死区组织代谢;体内表达的hBMP-7目的蛋白通过增加股骨头区骨矿物质密度,改善股骨头骨生物力学强度,促进髓芯减压后骨生成.rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7组重组腺相关病毒载体较rAAV-hVEGF 165-IRE S-hrGFP组及rAAV-hBMP-7-IREShrGFP组更有效的提高了兔早期激素性股骨头坏死的修复效果.结论:hVEGF165和hBMP-7双基因共表达重组腺相关病毒载体通过增加股骨头组织的血运及增强股骨头骨质量提高兔早期激素性股骨头坏死的修复作用.

摘要： 目的:探讨直接心肌注射基因重组hVEGF165腺相关病毒(rAAV-hVEGF165)对急性心肌梗死大鼠心功能的影响。rn 方法:取81只雄性Sprague-Dawley大鼠,体重260～300之间。结扎冠状动脉左前降支,制备急性心肌梗死大鼠模型。心梗后即刻,将大鼠随机分成4组:假手术组(n=15);心肌梗死组(MI组,n=25);生理盐水组(NS组,n=25);VEGF组(n=16)。NS组和VEGF组分别接受生理盐水或rAAV-hVEGF165 100μL分三点注射于梗死交界处心肌内。于注射4周后测定心肌组织VEGF含量、超声心动图参数、梗死范围、微血管数量、心钠素( Atrial Natriuretic Peptide,ANP)水平。rn 结果:假手术组中3只大鼠、MI组中13只大鼠、NS组中15只大鼠、VEGF组中7只大鼠死亡(死亡时间),43只大鼠进入研究。VEGF组心肌梗死范围(%)较MI组和NS组明显减小(38.56±2.96 vs 42.5±3.75 vs 42.5±2.55,P<0.05)。VEGF组的左室射血分数(%)显著高于MI组和NS组(61.11±8.37 vs 44.17±5.31vs 39,40±5.48,P<0.01)。VEGF组中心肌组织VEGF含量较MI组和NS组有所增加(?)。血管计数显示,VEGF组有更多的新生血管形成(/mm2)(522.38±82.14 vs 419.99±32.17 vs 420.86±16.50, P<0.01)。rn 结论:梗死区交界处心肌内直接注射rAAV-hVEGF165能够显著改善急性心肌梗死大鼠的心功能,缩小梗死范围,促进心肌内新生血管的形成。

摘要： 目的:以腺相关病毒(AAV)为载体,将双突变的二氢叶酸还原酶(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因导入外周血造血干细胞,达到保护机体造血功能的目的,同时建立一个简便、易行的检测目的基因的体系。方法:构建携带人mDHFR和GFP融合基因的重组腺相关病毒载体(rAAV/mDHFR-GFP),包装成重组病毒:将重组病毒感染人外周血来源的CD34细胞,PCR、RT-PCR检测转染细胞的基因转染情况,MTT法检测转基因组与未转基因组耐药性差异,流式细胞仪和荧光显微镜观察基因转染率。结果:成功构建了rAAV/mDHFR-GFP重组载体并表达。PCR证实腺相关病毒载体可将mDHFR-GFPcDNA导入外周血造血干祖细胞。RT-PCR证实病毒转染后的CD34细胞中有mDHFR和GFPmRNA的存在,MTT法证实转基因细胞耐药性较未转基因细胞有一定提高。rAAv/mDHFR-GFP重组病毒感染外周血CD34细胞,感染率可高达25﹪,外周血CD34细胞中可见绿色荧光蛋白表达。结论:腺相关病毒载体可将mDHFR-GFP融合基因成功导入外周血干祖细胞,转入的目的基因在靶细胞中可有效表达,产生相应有功能的物质(包括蛋白质),使经转染的外周血干祖细胞对MTX的耐药性增强,今后仍需进一步改善AAV结构、包装系统和基因转染技术,以提高基因转导效率。

摘要： 目的:评价腺相关病毒(AAV)为载体介导前列腺特异抗原(PSA)基因转染树突状细胞(DCs)的可行性。方法:构建重组质粒d16-95/PSAp5/NeoSV40(简称rAAV/PSA/Neo),并制备该病毒。分离外周血单个核细胞(DCs前体细胞),采用GM-CSF,IL-4,TNF-α诱导。以rAAV/PSA/Neo病毒感染DC前体细胞,感染后72小时,流式细胞仪检测rAAV/PSA/Neo病毒感染效率及PSA表达情况,6天后,PCR/Southern blot分析PSA基因染色体整合情况。结果:AAV成功介导PSA基因转染DC,PSA基因在DCs内良好表达,病毒基因成功整合入DCs基因组内。结论:AAV载体成功介导PSA基因转染DCs,为以DCs为基础的前列腺癌基因治疗打下基础。

摘要： 目的：评价腺相关病毒(AAV)为载体介导前列腺特异抗原(PSA)基因转染树突状细胞(DCs)的可行性。rn 方法：构建重组质粒d16-95／PSAp5／NeoSV40(简称rAAV／PSA／Neo)，并制备该病毒。分离外周血单个核细胞(DCs前体细胞)，采用GM-CSF，IL-4，TNF-α诱导，以rAAV／PSA／Neo病毒感染DC前体细胞，感染后72小时，流式细胞仪检测rAAV／PSA／Neo病毒感染效率及PSA表达情况，6天后，PCR／Southern blot分析PSA基因染色体整合情况。rn 结果：AAV成功介导PSA基因转染DC，PSA基因在DCs内良好表达，病毒基因成功整合入DCs基因组内。rn 结论：AAV载体成功介导PSA基因转染DCs，为以DCs为基础的前列腺癌基因治疗打下基础。

摘要： 目的：以腺相关病毒(AAV)为载体，将双突变的二氢叶酸还原酶(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因导入外周血造血干细胞，达到保护机体造血功能的目的，同时建立一个简便、易行的检测目的基因的体系。rn 方法：构建携带人mDHFR和GFP融合基因的重组腺相关病毒载体(rAAV／mDHFR-GFP)，包装成重组病毒；将重组病毒感染人外周血来源的CD34+细胞，PCR、RT-PCR检测转染细胞的基因转染情况，MTT法检测转基因组与未转基因组耐药性差异，流式细胞仪和荧光显微镜观察基因转染率。rn 结果：成功构建了rAAV／mDHFR-GFP重组载体并表达。PCR证实腺相关病毒载体可将mDHFR-GFPcDNA导入外周血造血干祖细胞。RT-PCR证实病毒转染后的CD34+细胞中有mDHFR和GFPmRNA的存在，MTT法证实转基因细胞耐药性较未转基因细胞有一定提高。rAAV／mDHFR-GFP重组病毒感染外周血CD34+细胞，感染率可高达25％，外周血CD34+细胞中可见绿色荧光蛋白表达。rn 结论：腺相关病毒载体可将mDHFR-GFP融合基因成功导入外周血干祖细胞，转入的目的基因在靶细胞中可有效表达，产生相应有功能的物质(包括蛋白质)，使经转染的外周血干祖细胞对MTX的耐药性增强，今后仍需进一步改善AAV结构、包装系统和基因转染技术，以提高基因转导效率。

摘要： 目的:研究腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirusrAAV)载体介导的绿色荧光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)基因对体外原代培养的神经干细胞(neuralstemcellsNSCs)的转染效率及其对细胞增值、分化和迁移能力的影响.方法:取新生24h内的Wistar鼠的海马进行神经干细胞原代培养,用MTT法测定不同病毒滴度下对NSCs增值能力的影响;用免疫组化的方法进行NSCs、神经元及神经胶质细胞的鉴定和直接倒置荧光显微镜下细胞迁移距离的测定.结果:rAAV2-EGFP对NSCs的转染效率随着病毒滴度的增加而增加,在转染后的第11天效率最高,MOI=104、105、106在转染后的第11天分别是9.81％、56.30％、64.67％;不同病毒滴度转染NSCs后,MTT法测定的OD值,在不同的时间点随着病毒滴度的增加,OD值均明显减小,各组之间在不同的时间点均有显著的统计学差异;但不同滴度的rAAV2-EGFP转染NSCs,其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离,各组间无统计学差异.结论:rAAV2-EGFP转染NSCs,在MOI=105,106时,转染率较高,转染后第11天达到高峰,且不影响NSCs的分化和迁移能力,但对NSCs增殖能力有明显影响,其随着病毒滴度的增加,其影响程度亦明显增加.

摘要： 目的 构建重组人骨形态形成蛋白 4 基因腺相关病毒载体。 方法 根据hBMP4 的基因序列设计引物，上游引入 EcoR I 位点，下游引入 Sal I 位点，以 EX-A0242-M01－hBMP4 为模板扩增目的基因。将 hBMP4 基因克隆入 pUC18 载体中，获得重组质粒pUC18-BMP4。然后用 EcoRI+Sal I 酶切 pUC18-BMP4 及质粒 pSNAV，回收酶切片段，T4连接酶 16oc 过夜，转化大肠杆菌 DH5α感受肽细胞，筛选阳性克隆获得 pSNAV-hBMP4，EcoRI+SalI 双酶切鉴定，并行全基因测序。转染 BHK21 细胞， G418 筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2 感染，包装此细胞株并收获病毒载体 AAV-hBMP4。行 DNA点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGEF 分析判断病毒纯度。 结果 PCR 电泳及酶切鉴定表明 pSNAV-hBMP4 重组成功，基因测序显示装入 PSNAV 质粒中的 hBMP4 基因正确；AAV-hBMP4 病毒的大致滴度为 1.5×1012vg/ml，分泌蛋白浓度约为 0.124mg/ml，病毒载体的纯度在 95﹪以上。 结论 本实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，完全可以满足骨组织工程的需要。

摘要： 目的：缺血性脑卒中是危害人类健康的常见疾病。既往研究发现缺血区域的血管新生对恢复神经功能至关重要。脂联素是一种主要由脂肪细胞分泌的激素，有抗炎和抗动脉粥样硬化的作用，对缺血性脑损伤具有保护作用，但脂联素在抗缺血损伤中的机制目前仍不明确。本研究运用小鼠短暂性脑缺血模型，通过腺相关病毒(AAV)载体基因治疗的方法，观察脑缺血模型中脂联素对血管新生的影响，阐述脂联素在脑缺血中的作用机制。方法：(1)l20只小鼠分别接受AAV-GFP, AAV-APN或生理盐水脑定位注射治疗，7天后行短暂性大脑中动脉阻塞术，观察脂联素对脑缺血/再灌注小鼠脑萎缩程度、血管新生、磷酸化AMPK及血管内皮生长因子表达的影响。(2)30只APN组小鼠在tMCAO术前、术后腹腔注射AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)抑制刘Compound C，观察脑缺血/再灌注后脑萎缩程度、血管新生、P-AMPK及VEGF的表达情况。结果：(1)APN组小鼠缺血侧大脑半球萎缩程度为7.9左右，明显小于生理盐水组和GFP组，APN组缺血周边区血管密度为199。(2)缺血/再灌注后，APN组小鼠P-AMPK, VEGF的表达量在缺血侧脑组织中均增高，而Total AMPK的蛋白表达量在缺血前后无明显差异。(3)APN组小鼠经APMK抑制剂Compound C处理后，缺血侧大脑半球萎缩程度大于对照组，缺血侧脑组织中P-AMPK蛋白表达量、VEGF蛋白和mRNA的表达水平明显低于对照组，缺血周边区血管计数109。结论：脂联素减轻了脑缺血/再灌注后缺血半球的脑萎缩程度、增加VEGF在缺血组织中的表达并刺激血管新生。

摘要： 目的：关于AAV2载体介导TRAIL基因在BALB/c荷瘤鼠模型的生物分布研究。rn 方法：采用实时定量PCR技术，结合外标绝对定量方法进行。选择小鼠.-actin基因作为内参，分别对目的基因和内参基因设计引物和探针，分别测定各脏器组织样本中目的基因和内参基因的拷贝数。根据公式计算转换后，计算每只小鼠组织DNA中药物分布的拷贝数。考察该药物可以分布到达机体哪些组织器官，以及伴随着给药后时间延长的代谢消除情况。rn 结果：该药物主要分布在脾脏、肝脏、肿瘤组织和血液中，一些动物在肠系膜淋巴结、肺和骨髓中有少量分布，在其它脏器没有分布。随着给药后时间的延长，药物在体内逐渐被代谢消除掉，不会在体内长期蓄积。rn 结论：该药物在生殖系统和重要的生理器官都无分布，不会产生生殖遗传毒性和广泛的全身毒性反应。因此，推测该药物可以在临床上安全使用。

摘要： 本发明涉及新型AAV衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、包含该衣壳蛋白的载体以及包含该载体的药物。本发明的AAV载体具有高实心率，可作为治疗性基因的送递载体用于治疗各种疾病。

摘要： 本发明涉及新型AAV衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、包含该衣壳蛋白的载体以及包含该载体的药物。本发明的AAV载体具有高实心率，可作为治疗性基因的送递载体用于治疗各种疾病。

摘要： 本发明公开了一种重组腺相关病毒包装质粒、重组腺相关病毒及其应用。所述重组腺相关病毒包装质粒包括2型腺相关病毒的Rep基因和11型腺相关病毒的Cap基因。所述重组腺相关病毒，由所述的重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒共转染包装细胞系获得。本发明制备的重组腺相关病毒具备标记特定脑区及其上游连接网络的特性，且逆行标记效率更高。本发明解决了现有逆行标记方法效率低的难题，为神经科学研究、疾病模型建立和基因治疗等提供了更好的工具和技术支撑，具有广泛的应用价值和市场前景。

摘要： 本发明涉及能够提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的包装效率的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其在提高这种rAAV的包装效率的用途。特别地，本发明涉及重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其被进一步修饰为使用与不同血清型的rAAV的Rep蛋白相关的AAV P5和/或P40启动子替换(或增加)与通过这种rAAV编码的Rep蛋白天然相关的P5和/或P40启动子序列。使用这种替换或另外的启动子序列造成重组修饰腺相关病毒的生产增加。

摘要： 本发明提供了环状RNAcircTTC3过表达腺相关病毒载体、腺相关病毒及其应用，属于生物医药技术领域。本发明利用AAV9病毒载体递送环状RNA‑circTTC3能够用于制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤(IRI)的药物。本发明基于AAV病毒将能够转录出环状RNA‑circTTC3的基因序列递送至心脏组织中，并在心脏组织中稳定的高表达，上调circTTC3能产生心脏保护效应，有效减少心肌梗死面积，从而起到保护心肌梗死的作用。本发明通过在新生大鼠原代心肌细胞中过表达circTTC3，发现circTTC3可以显著性地促进新生大鼠原代心肌细胞的增殖和生长。

摘要： 提供腺相关病毒(AAV)结合性蛋白的稳定性、特别是对热、酸、碱的稳定性得到改善的改良AAV结合性蛋白、该蛋白的制造方法以及使用了该蛋白的AAV吸附剂。

摘要： 提出了用于腺相关病毒(AAV)的稳定剂和使用所述稳定剂稳定腺相关病毒的方法。更具体地，本公开内容涉及用于腺相关病毒的稳定剂，其包含表面活性剂或白蛋白；腺相关病毒液体制剂，其包括腺相关病毒稳定剂；以及具有改善的稳定性的腺相关病毒的生产方法。当使用腺相关病毒产生基因递送病毒和治疗性纳米颗粒并为此目的形成另外的多酚结合物时，根据本公开内容的技术抑制病毒之间的过度聚集，从而将颗粒尺寸维持在用于药物递送的有效尺寸并改善液相的稳定性。因此，预期所述技术在用于基因疗法的药物递送技术领域中非常有用。

摘要： 本发明提供一种用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：特异性序列，至少包括用以与ITR序列T形发夹结构长茎回文靠近5’端的第一侧茎的部分或全部序列段互补配对的第一序列，及用以与所述T形发夹结构第一侧茎相邻的部分第一非互补配对序列段互补配对的第二序列；末端修饰结构，用以阻止特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸。本发明还提供一种腺相关病毒DNA复制方法及应用。试剂与腺相关病毒ITR序列T形发夹结构相竞争，形成特异性序列与腺相关病毒单链DNA模板的杂交产物，同时解链该模板中T形发夹结构，在引物延伸过程中消除模板中T形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用。

摘要： 本发明属于生物技术领域，涉及一种重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒及其应用。该重组腺相关病毒载体为将PD‑1细胞外段核苷酸序列插入腺相关病毒载体而形成的载体；所述PD‑1细胞外段核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的重组腺相关病毒载体，将PD1的胞外段(共170个氨基酸)插入至腺相关病毒AAV8表达后分泌出可溶性PD1，这样就能够通过可溶性PD1与肿瘤细胞上的PDL1结合，有效阻断PD‑1/PD‑L1信号通路，以阻止肿瘤细胞上的PDL1与T细胞上PD1结合而避免T细胞耗竭，改善宿主的T细胞功能，提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，并且对正常的细胞、组织和器官几乎无损伤，具有极高的安全性和可靠性。

摘要： 提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法，例如，高达5E+13(5×1013)个载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。