透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性

摘要

[目的]马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S (streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题.本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sagA基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响.[方法]利用温度敏感/自杀性质粒pJR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sagA基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sagA基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sagA基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究.[结果]获得了透明质酸产量提高30％而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sagA基因缺失突变株.该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低.细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sagA基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异.[结论]在马链球菌兽疫亚种中sagA不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sagA基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hy1c和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用.