摘要：目的:着眼于牛结核患病牛全血中白细胞中关于干扰素诱导基因的表达差异研究,对中性粒细胞在牛结核病中的致病机制提供新的补充。方法:1、结核阴性牛和阳性牛的确定:采用PPD结核菌素皮试反应和全血γ干扰素酶联免疫试剂盒进行双检测;2、牛外周血中性粒细胞的分离和提取:采用密度梯度分离液进行分离。3、RNA的提取:细胞总RNA的提取使用Promega公司的RNA提取试剂盒,使用Fermentas公司的反转录试剂盒合成cDNA,荧光定量PCR采用SYBER Green1的方法,检测基因包括IFN-γ相关(6个:CXCL10,IFI44,STAT1,TAP2,CD274,PD-1)和typeⅠIFN-α/β(5个:IFI6,IRF7,STAT1,STAT2,OAS1).4、数据统计:采用双Δt进行双尾T检验数据分析。结果:1.牛结核感染阴性牛和阳性牛的确定:上述两种进行双检测,双阳性者判定为牛结核感染牛。2.中性粒细胞体外感染牛结核分支杆菌后干扰素诱导基因的表达水平变化:牛外周血中性粒细胞进行体外牛结核杆菌的感染,分别在感染6h和18h后检测干扰素诱导基因的表达。结果发现:上调的基因都包含在γ干扰素相关的转录基因中,而typeⅠIFN-α/β中,只有STAT2的基因表达变化显著。3.牛结核阳性牛的中性粒细胞其干扰素诱导基因的表达水平激活:根据结果1,将待测样本分为三组:阴性牛,牛结核感染阳性牛,禽结核与牛结核共同感染牛。其检测结果显示:牛结核阳性牛中的待检基因与阴性牛相比,表达水平差异,其中8个基因上调,2个基因下调(TAP2和PD-1).共同感染牛与结核感染牛的表达相比,趋势类似,但是程度不强烈。结核感染牛中3个IFN-γ相关的CD274、STAT1、CXCL10以及Ⅰ型干扰素相关的IFI6、IRF7、STAT2和OAS1的表达显著上调。4.牛结核感染过程中中性粒细胞的PTX3和MPO的表达变化:牛结核感染牛中中性粒细胞上PTX3和MPO的表达也有很大的差异,表现在MPO的表达在结核感染牛中的表达显著升高,但是PTX3的表达显著下降。结论:与健康牛相比,牛结核阳性牛中其全血中中性粒细胞中的干扰素诱导基因包括IFN-γ和typeⅠFN-α/β的通路过量表达,验证了之前的假设,为牛结核病的诊断和治疗提供新的靶点。
