β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp320的相关性分析

摘要

[目的]为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽(316KSPDGGN322)组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段(PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af.为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp320的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af D320G.[方法]采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af基因(Auman5A/Af中编码Asp320的密码子GAC突变为Gly320的GGT,构建出突变体基因Auman5A/AfD320G,并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af D320G的酶学性质.[结果]AuMan5A/Af D320G的最适温度Topt为70.0℃,变性温度Tm为71.5℃,介于AuMan5A (Topt=65.0℃,Tm=64.5℃)和AuMan5 A/Af (Topt=75.0℃,Tm=76.6℃)之间;在70.0℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率(kcat/Km)分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍. [结论]将Asp320突变为Gly320显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp320对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用.