来源于Caldibacillus cellulovorans的耐热甘露聚糖酶的全基因合成,表达及酶学性质分析

摘要

甘露聚糖酶(mannanase)来源广泛，大量存在于植物，动物和微生物。其中微生物存在种类繁多、性质优良的甘露聚糖酶，且易于培养，是理想的β-甘露聚糖酶来源。已有大量来源于细菌的甘露聚糖酶被研究，其中耐热甘露聚糖酶的研究仍受到科学家们的关注。在食品、饲料等众多行业中，需要大量高温环境下使用的生物活性添加剂，其相关高反应温度，耐热性好的酶类仍然缺乏研究。国内外已有研究出的耐热甘露聚糖酶，目前还没有能够得到很好推广利用，应用很有限，其原因是市场供给不足，酶学性质难以工业化使用，并且价格高。挖掘出耐热效率高并利用高效表达系统使该甘露聚糖酶进行外源高效率表达，从而低成本、规模化地大量生产甘露聚糖酶酶供更多人所用，无疑是解决这一问题的有效方法之一。
　　本研究应用基因工程，蛋白工程和发酵工程技术获得具有自主知识产权的甘露聚糖酶高产工程菌，为甘露聚糖酶在食品与饲料方向的工业化应用提供理论依据和条件，本研究主要工作包括以下内容：在不改变耐热甘露聚糖酶ManAd3原始氨基酸序列的基础上，根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列，为了提高甘露聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中的表达量，参照巴斯德毕赤酵母密码子使用情况，优先选择毕赤酵母最偏爱的密码子，部分使用次偏好密码子，从而尽量消除mRNA稳定的二级结构，设计并全基因合成了甘露聚糖酶基因ManAHr(Accession No.KJ806637)。将人工合成的甘露聚糖酶基因 ManAHr利用基因工程技术与pPIC9k质粒进行连接，构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9k-ManAHr，并将其转化毕赤酵母GS115得到重组子，该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定，其中甘露聚糖酶ManAHr含量达到电泳纯级别，分子量大小约为30 kDa。通过发酵罐发酵条件的优化，寻找重组蛋白的表达的最佳发酵条件，通过甲醇与甘油不同比例的混合补料，有效的避免了甲醇中毒情况，进一步提高了甘露聚糖酶的产量。
　　实验结果表明，重组甘露聚糖酶酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃，最适反应pH为6.0，比活力高达3200 IU/mg，并且在75℃下处理30 min仍能维持90％以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManAHr因表达量较高，在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力，且热稳定性显著，可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域，根据目前发酵罐小试的产量，在工业化大规模生产中前景广泛。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

1.1甘露聚糖

1.2甘露聚糖酶

1.3 外源基因表达系统

1.4 研究目的和意义

第二章 甘露聚糖酶ManAHr在毕赤酵母中的表达

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3实验结果与分析

2.4 本章小结

第三章 甘露聚糖酶ManAHr酶学性质的鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4本章小结

第四章 甘露聚糖酶ManAHr发酵罐水平表达及发酵条件优化

4.1发酵条件优化简介

4.2实验材料

4.3实验仪器

4.4实验方法

4.5 结果与分析

4.6本章小结

结论

参考文献

致谢

附录

研究生期间发表的文章