双亚基共表达重组人白细胞介素12真核质粒pEGFP-C1_IL-12的构建及表达

摘要

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人白细胞介素12双亚基目的基因(hIL-12,P35、P40)的真核表达质粒pEGFP-C1_IL-12,为进一步研究基因的定位、表达及hIL-12的抗肿瘤作用奠定基础.方法 提取脂多糖(LPS)诱导后的人脐带血淋巴细胞总RNA,RT-PCR法扩增人白细胞介素12的双亚基P35和P40的全长cDNA,采用重叠PCR法连接两个亚基,双酶切双亚基片段及载体pEGFP-C1,T4 DNA连接酶连接,重组质粒转化大肠埃希菌,挑取阳性克隆,PCR、双酶切及测序鉴定证实质粒构建成功.借助脂质体将重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过荧光显微镜检测报告基因的表达,RT-PCR及Western blot法检测目的基因的表达.结果 PCR及测序鉴定证实重组质粒pEGFP-C1_IL-12构建成功,RT-PCR及Western blot法证实重组质粒在HepG2细胞内正常表达.结论 携带报告基因(GFP)和双亚基目的基因(hIL-12,P35、P40)的重组真核质粒pEGFP-C1_IL-12构建成功,并能在人肝癌细胞系HepG2中表达.