重组人β分泌酶(BACE1)的表达纯化及酶学评价

摘要

BACE1抑制剂的活性评价和作用模式研究需要大量活性良好的BACE1。商品BACE1成本很高，因此需要利用原核或真核表达系统大量制备BACE1。为此本研究分别构建了携带proBACE1和BACE1编码序列的分泌型毕赤酵母重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46，以及携带proBACE1编码序列的大肠杆菌重组表达质粒pET-32a-MetBACE22，用于表达proBACE1和BACE1重组蛋白。结果显示大肠杆菌表达的重组proBACE1无活性，而转入proBACE1基因的重组毕赤酵母9k-B22的发酵液上清活性明显高于转入成熟型BACE1基因的重组菌株9k-B46的发酵液上清活性。SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现纯化得到的proBACE1是被高度糖基化的蛋白（在SDS-PAGE上表现为85 kD为中心的分散条带），其糖基化可以被糖苷内切酶Endo Hf完全切除，得到50kD左右的两条蛋白带。使用肽质量指纹图谱鉴定发现，分子量较高的条带与proBACE1匹配，而另外一条与BACE1匹配。这说明proBACE1可以在毕赤酵母中加工为成熟型。本研究还发现纯化的proBACE1存在一定程度的自催化现象，导致42 kD和39kD两条蛋白带的出现。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK293细胞（人胚肾细胞）表达的商品BACE1，去除糖基化后活性降低了40％，这说明糖基化及其类型对BACE1活性非常重要。本课题组以前分离得到的BACE1抑制剂AV-4-1对糖基化BACE1、去糖基化BACE1以及商品BACE1的抑制率无显著差异，这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化（培养基pH、甲醇浓度、接种量、酸水解酪蛋白含量、培养温度以及瓶塞类型等），BACE1表达量有一定提高，约为1 mg/L。为下一步测定BACE1非竞争性抑制剂作用模式奠定了物质基础。

目录

英文缩略词

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

1 实验材料与设备

1．1 菌种与质粒

1．2 试剂与耗材

1．3 常用溶液与培养基

1．4 常用设备

2 实验方法

2．1 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2 对大肠杆菌的转化

2．3 小量提取质粒(试剂盒法)

2．4 引物设计

2．5 质粒DNA的PCR扩增

2．6 TA克隆构建克隆载体

2．7 菌落PCR筛选重组菌

2．8 大量提取质粒

2．9 回收DNA片段(试剂盒法)

2．10 乙醇沉淀回收DNA片段

2．11 在质粒载体中进行DNA克隆

2．12 proBACE1在大肠杆菌中表达

2．13 将重组质粒转入毕赤酵母并诱导其分泌表达

2．14 FRET法测定BACE1蛋白酶活性以及抑制率

2．15 SDS-PAGE检测(考马斯亮蓝及高碘酸-希夫试剂染色法)

2．16 Western blot检测

2．17 Bradford法测定蛋白浓度

第三章 结果与讨论

1 重组质粒的构建

1．1 构建克隆载体

1．2 构建重组表达质粒

2 proBACE1在大肠杆菌中表达

3 proBACE1和BACE1在毕赤酵母中表达

3．1 毕赤酵母的转化和筛选

3．2 重组毕赤酵母发酵液上清的活性比较与分析

3．3 表达条件优化

3．4 重组蛋白的纯化与鉴定

3．5 Bradford法测定总蛋白含量

3．6 天然状态下BACE1去糖基化

3．7 不同类型BACE1之间活性的比较

3．8 proBACE1自催化现象的初步探讨

总结

参考文献

综述：光亲和标记在药物靶标以及作用位点发现中的应用

附录

1 DNA测序以及比对结果

1．1 pEASY-T1S-MetBACE22和pEASY-T1S-MetBACE46的测序结果

1．2 pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46的测序结果

1．3 pET-32a-MetBACE22的测序结果

2 肽质量指纹图谱比对结果

2．1 BL肽质量指纹的检索结果

2．2 BH肽质量指纹的检索结果

致谢

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