甜菊糖苷类甜味剂的分离纯化与生物转化

摘要

作为甜味植物，甜叶菊和甜茶叶中含有大量的甜菊糖苷，例如stevioside、rebaudioside C、rebaudioside A和rubusoside。这些甜菊糖苷类物质具有高甜度、低热能特性，适用于糖尿病患者、肥胖症患者和动脉粥样硬化病人的饮食中。因此，甜菊糖苷逐渐成为研究的热点。目前甜菊糖苷已作为甜味剂，用于食品、药品等领域。
　　 本文主要对甜叶菊中的主要甜味物质，以及甜茶叶中的主要甜味物质进行分离与纯化研究:确定两种植物中甜味物质的提取方案;利用大孔吸附树脂对两种植物中的甜味物质进行分离;利用制备型高效液相色谱分别对两种植物的粗提物进行纯化;最后，对甜菊糖苷的生物转化进行了初步探索。
　　 1.首先确定了甜叶菊中甜菊糖苷的检测方法，即利用HILIC色谱柱对其进行分析与定量。确定了甜茶叶中rubusoside的检测方法，即利用C18色谱柱进行分析与定量。
　　 2.确定了从甜叶菊中提取stevioside、rebaudioside A和rebaudioside C的条件为:固液比1∶10，温度100℃，提取时间60min，提取三次，提取率为97.23％。确定大孔吸附树脂分离stevioside、rebaudioside A和rebaudioside C的最佳分离工艺条件:选用HP-20树脂，上样浓度为水提三次的原料液（浓度约为6mg/mL），上样流速4BV/h，上样量13BV，去离子水洗3BV，用70％乙醇在3BV/h条件下洗脱产品。经过HP-20初步分离之后，用D941阴离子交换树脂进行脱色，水洗得到粗提物。叶片中甜菊糖苷含量为8.21％，将1009甜叶菊叶片按照上述最优工艺提取。再利用HP-20树脂分离纯化，可得到14.25g纯度为48.9％的粗提物，经过D941之后，可以得到10.39g的纯度为63.7％的粗提物，树脂纯化的收率为83.0％。利用HILIC制备柱，从甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）粗提物中纯化得到三种单体:stevioside、rebaudioside C和rebaudioside A。纯化条件如下:色谱柱Venusil HILIC制备柱(21.2×250mm，5μm100A)，流动相V乙腈∶V水＝83∶17，流速10mL/min，检测波长213nm。结果显示，最大上样量可达200mg，此时得到79.2mg的stevioside、7.4mg的rebaudioside C和33.7mg的rebaudioside A，纯度分别为:97.5％，96.8％和97.2％。
　　 3.从甜茶叶中提取rubusoside的工艺:同上，提取收率为97.44％。得到大孔吸附树脂分离rubusoside的工艺为:上样液浓度为水提三次的原料液(浓度约为2mg/mL)，上样流速3BV/h，上样量13BV;在3BV/h条件下，先用3BV去离子水洗杂质，后用3BV的30％乙醇洗脱杂质，然后用90％乙醇洗脱产品。再用D941树脂进行脱色。叶片中甜茶甙含量为4.5％，将1009甜茶叶按照上述最优工艺提取，再利用HP-20树脂分离纯化，可得到7.31g纯度为52.1％的粗提物，经过D941树脂，可以得到5.22g纯度为68.6％的甜茶甙粗品，树脂纯化的收率为82％。利用C18制备柱，从甜茶叶(Rubus suavissimus S.Lee)粗提物中纯化rubusoside。确定的工艺条件为:反相C18色谱柱(19×300mm，7μm，Waters)，流动相V甲醇∶V水＝75∶25，流速10mL/min，检测波长213nm。上样量为200mg，依然可以达到良好的分离，从而得到123.4mg纯度为97.9％的甜茶甙单体。
　　 4.鉴于stevioside有后苦味，rubusoside口感较佳，且甜茶叶的产量较低，因此本文还对stevioside转化为rubusoside的菌株进行了筛选，从而获得了一株霉菌，用于转化。得到的转化培养基，经过HP-20树脂纯化后，得到的转化产物中甜菊糖苷含量为75.44％，且所含rubusoside、stevioside、rebaudioside C和rebaudioside A的相对含量分别为:43.8％，20.4％，7.9％和27.9％。而最初底物所含rubusoside、stevioside、rebaudioside C和rebaudioside A的相对含量分别为0、66.72％、11.28％、22％。因此甜叶菊提取物经过转化后得到的产品stevioside相对含量降低，rubusoside和rebaudioside A相对含量升高，所以后苦味降低，甜度加强，从而改善了产品的甜度。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

第一章 绪论

1．1 甜叶菊

1．1．1 甜菊糖苷

1．1．2 甜菊糖苷吸收、分布、代谢与排泄

1．1．3 毒性或不良反应

1．1．4 作用以及活性

1．1．5 甜菊糖苷的应用

1．1．6 甜菊糖苷的检测

1．1．7 甜菊糖苷的提取

1．1．8 甜菊糖苷的纯化

1．1．9 甜菊糖苷改性

1．2 甜茶叶

1．2．1 甜茶叶简介

1．2．2 甜茶叶的作用

1．2．3 甜茶的应用

1．2．4 甜茶甙的分析

1．2．5 甜茶甙的提取

1．2．6 甜茶甙的纯化

1．3 选题的意义和研究内容

1．3．1 选题的意义

1．3．2 研究内容

第二章 甜菊糖苷类甜味剂的检测

2．1 前言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 检测方法的确定

2．3．2 标准曲线的测定

2．3．3 精密度实验

2．3．4 检测限与定量限

2．4 结果与讨论

2．4．1 检测条件的确定

2．4．2 标准曲线的绘制

2．4．3 精密度实验

2．4．4 检测限与定量限

2．5 小结

第三章 甜叶菊中甜菊糖苷类甜味剂的提取、纯化与鉴定

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)中甜味物质的提取与树脂分离

3．3．2 甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)中甜味物质的制备纯化

3．3．3 物质鉴定

3．4 结果与讨论

3．4．1 甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)甜味物质的提取与树脂分离

3．4．2 甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)中甜味物质的制备纯化

3．4．3 物质鉴定

3．5 小结

第四章 甜茶叶中甜菊糖苷类甜味剂的提取、纯化与鉴定

4．1 前言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 甜茶叶(Rubus suavissimus S．Lee)中甜味物质的提取与树脂分离

4．3．2 甜茶叶(Rubus suavissimus S．Lee)中甜味物质的制备纯化

4．3．3 物质鉴定

4．4 结果与讨论

4．4．1 甜茶叶(Rubus suavissimus S．Lee)中甜昧物质的提取与树脂分离

4．4．2 甜茶叶(Rubus suavissimus S．Lee)中甜昧物质的制备纯化

4．4．3 物质鉴定

4．5 小结

第五章 甜菊糖苷类甜味剂的生物转化初步研究

5．1 前言

5．2 实验材料与仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 菌种筛选

5．3．2 菌种培养与转化

5．3．3 转化产物的纯化

5．4 结果与讨论

5．4．1 菌种筛选

5．4．2 菌种培养与转化

5．4．3 转化产物的纯化与鉴定

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介

硕士研究生学位论文答辩委员会决议书