无痕敲除构建米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株

摘要

米曲霉因其具有较强的产酶能力被广泛应用于食品工业等方面，我国在生产实践中主要使用米曲霉沪酿3.042作为发酵菌株。但是，由于其多核、多孢的特性，使得近三十年来在遗传育种方面的研究进展困难重重。本论文利用同源重组技术敲除米曲霉pyrG标记基因（乳清酸-5''-单磷酸脱羧酶），得到可以稳定遗传的米曲霉沪酿3.042尿嘧啶营养缺陷型菌株，即菌株T4、T25、T35，可为后续对米曲霉的分子生物学操作及遗传育种奠定基础。　　由于米曲霉孢子多核的特性，使得通过传统手段筛选得到的突变体无法稳定遗传，因此，本论文利用本课题组前期从米曲酶沪酿3.042中筛选得到的稳定产单核孢子的米曲霉3.042-3作为受体。为达到无痕敲除的目的，本论文首先构建打靶载体YEplac195-PU-PD，将米曲霉pyrG基因上下游片段无缝连接，与基因组同源，防止引入外源基因。再对质粒YEplac195-PU-PD双酶切得到片段PU-PD。制备米曲霉3.042-3原生质体，将得到的片段PU-PD导入。利用1.4g/L浓度的5-FOA抗性平板筛选得到35株转化子，分别接种到MM培养基和SM培养基上，对它们进行传代尿嘧啶依赖性验证，从中挑取表现最好的3株转化子4号、25号、35号，对它们进行5-FOA抗性验证，证明它们可以在表型上稳定遗传。同时，对它们进行基因水平的验证，PCR结果证明，已经成功敲除了pyrG基因的开放阅读框。再通过细胞核DAPI染色观察发现，3株转化子均表现出单核的特性。因此，米曲霉沪酿3.042尿嘧啶营养缺陷型菌株构建成功，命名为菌株T4、T25、T35。　　从野生型米曲霉沪酿3.042中扩增得到pyrG基因，构建互补质粒pMD19-T-pyrG，将其转化到新菌株T4、T25、T35中，可以观察到它们均恢复野生型状态，即恢复自产尿嘧啶的能力。因此，这3株菌株T4、T25、T35可以作为pyrG标记基因的转化体系受体。

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