基于3T3-L1细胞的花椒籽仁油PUFA降脂活性及氧化损伤影响研究

摘要

花椒籽含有丰富的油脂和蛋白质，其理论产量比花椒果皮高出20％，年产量约60万吨，但它在花椒加工生产中常常被当作废弃物进行填满或者焚烧处理，既极大的浪费了有用资源，又造成严重的环境污染。如何将这一营养价值高、产量大的资源进行合理的开发利用，是众多领域的专家共同关注的问题。　　本实验室在进行花椒籽深度开发时通过螺旋压榨制得香味醇厚纯天然的高营养保健食用油——花椒籽仁油，发现花椒籽仁油中含有丰富的多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，PUFA)，其n-3系的α-亚麻酸(34.0％)和n-6系的亚油酸(29.9％)的比例约为1∶1，并且采用乙醇钠催化法和硝酸银络合法制得的花椒籽仁油多不饱和脂肪酸乙酯(PUFAEE)中n-3系的α-亚麻酸乙酯与n-6系的亚油酸乙酯的比例约为5∶1，本文在此基础上利用3T3-L1前脂肪细胞模型研究花椒籽仁油PUFA和PUFAEE的降脂活性。首先研究纯度较高的n-3系PUFA（如α-亚麻酸，α-Linolenicacid，ALA）和n-6系PUFA(如亚油酸，linoleicacid，LA)对3T3-L1细胞增殖和分化的影响，然后再检验花椒仁油PUFA和PUFAEE干预3T3-L1细胞增殖和分化的作用，最后尝试从脂质过氧化作用造成氧化损伤的角度探讨PUFA影响3T3-L1细胞分化的机理。　　(1)n-3/n-6系PUFA对3T3-L1细胞增殖分化的影响研究　　本文以3T3-L1前脂肪细胞为模型，采用MTS比色分析法和细胞形态学分析方法，研究不同浓度ALA、LA对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响;同时利用3T3-L1细胞在地塞米松、胰岛素和黄嘌呤的诱导下可特异性分化为成熟脂肪细胞，然后通过油红O染色，间接反应不同浓度的ALA、LA和1∶1ALA/LA混合脂肪酸对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。MTS结果显示，ALA、LA均能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，在无明显细胞毒性的浓度范围内呈剂量-效应关系，在24-72h范围内表现出时间-效应关系，且ALA抑制效果强于LA;细胞形态学分析结果显示，ALA、LA在高浓度时均显示出细胞毒性作用;倒置显微镜观察和油红染色检测结果显示，ALA、LA和1∶1ALA/LA混合脂肪酸均表现出显著抑制3T3-L1细胞分化的作用效果，在12.5-200μM浓度范围内呈浓度-效应关系，且ALA抑制分化作用强于LA，但当浓度＞100μM时，1∶1ALA/LA混合脂肪酸的抑制分化作用强于同浓度的ALA。　　(2)花椒籽仁油PUFA和PUFAEE干预3T3-L1细胞增殖分化的效果研究　　花椒籽仁油PUFA和PUFAEE分别以100μM、200μM、400μM干预3T3-L1细胞增殖过程。MTS结果显示，花椒籽仁油PUFA和PUFAEE均能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，在无细胞毒性的浓度范围内，表现出剂量-效应关系;细胞形态学分析发现，花椒籽仁油PUFA在400μM时表现出细胞毒性作用，而花椒籽仁油PUFAEE在400μM未见细胞毒性作用;分化实验结果表明，花椒籽仁油PUFA和PUFAEE均能在200μM下表现出对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用，且花椒籽仁油PUFAEE的抑制作用强于同浓度的花椒籽仁油PUFA。　　(3)花椒籽仁油PUFA和PUFAEE对3T3-L1分化过程中氧化损伤的影响研究　　通过测定花椒籽仁油PUFA和PUFAEE干预3T3-L1分化过程中细胞内的丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽(GSH)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)酶活，考察其对3T3-L1分化过程中氧化损伤的影响。结果显示，花椒籽仁油PUFA和PUFAEE干预细胞内MDA水平均明显高于相应的对照组，而SOD酶活及GSH水平均显著降低，且PUFAEE具有相对较低的MDA水平、相对较高的SOD酶活及相对较高的GSH水平，表明PUFAEE具有更强的氧化稳定性。提示乙酯化的PUFA在相同浓度下具有更好的抑制分化作用可能与其具有更强的氧化稳定性有关。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1．1 课题研究意义

1．2 多不饱和脂肪酸生物活性研究进展

1．2．1 抗心血管疾病

1．2．2 抗炎

1．2．3 调节脂质代谢

1．2．4 抗肿瘤

1．2．5 促进生长发育

1．2．6 抗心律失常

1．2．7 其它功能

1．2．8 n-3和n-6系PUFA膳食平衡问题

1．3 PUFA对3T3-L1细胞增殖分化的影响

1．3．1 3T3-L1细胞增殖与分化研究进展

1．3．2 PUFA对3T3-L1细胞增殖分化的影响研究

1．4 PUFA与氧化损伤关系的研究进展

1．5 论文的研究思路与内容

1．5．1 研究思路

1．5．2 研究内容

1．5．3 创新点

第2章 n-3／n-6 PUFA对3T3-L1前脂肪细胞的增殖分化影响研究

2．1 材料与仪器

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 试剂的配制

2．1．3 主要仪器设备

2．2 实验内容与方法

2．2．1 细胞复苏

2．2．2 细胞培养

2．2．3 细胞传代

2．2．4 细胞冻存

2．2．5 MTS法检测PUFA对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

2．2．6 细胞形态学分析

2．2．7 3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化

2．2．8 油红O染色

2．2．9 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中脂肪积聚的定量检测

2．2．10 统计方法

2．3 实验结果分析与讨论

2．3．1 PUFA对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

2．3．2 PUFA对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

2．3．3 结果讨论

2．4 本章小结

第3章 花椒籽仁油PUFA和PUFAEE对3T3-L1细胞的增殖分化影响研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 试剂的配制

3．1．3 主要仪器设备

3．2 实验内容与方法

3．2．1 花椒籽仁油PUFA及其乙酯对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

3．2．2 细胞形态学分析

3．2．3 花椒籽仁油PUFA及其乙酯对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

3．2．4 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中脂肪积聚的定量检测

3．2．5 统计方法

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 增殖实验结果

3．3．2 分化实验结果

3．3．3 结果讨论

3．4 本章小结

第4章 PUFA对3T3-L1细胞分化过程中氧化损伤的影响研究

4．1 材料与仪器

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 试剂的配制

4．1．3 主要仪器设备

4．2 实验内容与方法

4．2．1 细胞培养及诱导分化

4．2．2 蛋白浓度测定方法

4．2．3 脂质过氧化产物丙二醛含量测定

4．2．4 还原型谷胱甘肽含量测定

4．2．5 超氧化物歧化酶活力评估

4．2．6 统计方法

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 花椒籽仁油PUFA及PUFAEE对3T3-L1细胞分化过程中MDA水平的影响

4．3．2 花椒籽仁油PUFA及PUFAEE对3T3-L1细胞分化过程中GSH水平的影响

4．3．3 花椒籽仁油PUFA及PUFAEE对3T3-L1细胞分化过程中SOD水平的影响

4．3．4 结果讨论

4．4 本章小结

结论与建议

1．结论

2．建议

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录B 攻读学位期间所获奖励