我国慢性胰腺炎主要致病基因的突变分布及其临床意义

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分:我国慢性胰腺炎主要致病基因型及其对临床病程的影响　　目的：　　慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是多种因素引起的胰腺的慢性纤维炎症性疾病，可导致不可逆的形态变化和内外分泌功能的进行性损伤。CP的病程迁延、预后不良，患者的生活质量极差，严重的甚至发生胰腺癌。但由于CP病因机制不清，故目前尚缺乏根治方法。随着遗传学研究的进展，人们越来越认识到遗传学因素在CP发生、发展及临床结果等方面的重要作用。　　迄今为止，遗传学家们已经基本确认了SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR四个基因是CP的主要易感基因。然而，其致病突变对疾病发病年龄和临床结果的潜在影响，以及它们与环境危险因素的潜在相互作用仍不清楚。多项研究发现中西方CP人群存在显著遗传学差异，欧美的研究结果不能完全代表中国CP人群的数据。因此，开展中国CP人群大规模的易感基因的二代靶向测序，探索基因型-表型的关联至关重要。　　测序结果显示，我国超过半数的CP突变阳性患者携带SPINK1致病基因型，而其中最具常见的是SPINK1 c.194+2T＞C突变。这与西方报道的研究结果存在很大差异。因此，本研究进一步对SPINK1 c.194+2T＞C突变与CP的相关性进行Meta分析，探究其在CP不同种族和病因中的作用差异。　　本研究的目的是建立中国人群大型CP队列，筛查SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR基因中的罕见致病突变，并探讨其与发生CP风险的相关性。同时，对SPINK1c.194+2T＞C突变与CP的相关性进行Meta分析。　　方法：　　对1061名汉族CP患者和1196名对照的4个CP相关基因的目标区域进行了靶向测序，并用Sanger测序进行验证。为了评估基因-环境相互作用，将患者分为三个亚组:特发性CP(idiopathic CP，ICP)，酒精性CP(alcoholic CP，ACP)和吸烟相关CP(smoking-associated CP，SCP)。使用Kaplan-Meier模型评估罕见致病突变对CP发病年龄和临床结果的潜在影响。使用PubMed和EMBASE数据库，对2000年1月至2018年1月期间发表的有关SPINK1c.194+2T＞C突变与CP相关性的文献进行系统评价和Meta分析，并按种族和病因分类后进行亚组分析。　　结果：　　1、在535名(50.42％) CP患者中发现了涉及SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR基因的罕见致病基因型，但在对照中仅有71名(5.94％)（OR=16.12; P＜0.001），这显示出了遗传因素的显著作用。　　2、与致病基因型阴性的CP患者相比，阳性患者发病年龄更轻，胰腺结石、糖尿病和脂肪泻的诊断年龄更早。其中，阳性ICP患者起病、诊断为胰腺结石和诊断为糖尿病的中位年龄分别比阴性患者早14.4年、13.6年和15.9年。　　3、致病基因型在ICP、ACP和SCP中分别占57.1％、39.8％和32.1％，且对不同类型CP病程的影响也存在差异，ICP组最显著。　　4、不同致病基因型对临床病程的影响不同，首次提出与临床病程密切相关的基因分型标准:轻度为PRSS1基因p.G208A突变，中度为SPINK1基因c.194+2T＞C杂合突变，重度为PRSS1基因p.R122H和SPINK1基因c.194+2T＞C纯合突变。　　5、Meta分析结果显示SPINK1 c.194+2T＞C与东亚ICP密切相关。　　结论：　　1、SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR基因中的罕见致病基因型显著影响CP的发病年龄和临床结果。　　2、CP中存在广泛的基因-环境相互作用，首次将吸烟相关CP作为独立亚组进行分析。　　3、SPINK1 c.194+2T＞ C突变应作为我国CP最重要的筛查位点。　　第二部分:我国慢性胰腺炎主要致病基因SPINK1内含子突变的筛选及其功能分析　　目的：　　随着高通量测序等研究的广泛开展，慢性胰腺炎相关已知基因突变分布和临床意义越来越清晰。然而，在中国人群中依然有将近半数的CP患者无法找到致病突变。除了探索新基因，研究者们对已知基因的内含子区域开展了进一步的研究。SPINK1基因由于在CP患者中突变频率最高，因此受到关注。越来越多的SPINK1深度内含子区域的突变，随着高通量测序的应用而被鉴定出来。中国CP人群还缺乏大规模筛查SPINK1内含子突变的研究。　　尽管SPINK1基因中大部分经典剪接位点突变、无义突变或大片段基因组缺失的功能意义已研究清楚，但还有很多新发现的启动子和增强子突变、错义突变或与经典剪接位点同时发生的内含子突变的功能尚不明确。目前，已有多种方法应用于对SPINK1内含子突变在CP中的临床意义研究，包括软件剪接预测和体外的剪接功能分析实验。研究表明功能实验和软件剪接预测结果之间密切关联。据此，本研究设计了一套专门用于对SPINK1内含子突变进行分类的临床诊断流程，并且对其有效性和实用性进行探讨。　　方法：　　对52名遗传原因不明的中国汉族CP患者进行SPINK1内含子区域的靶向测序，鉴定新突变。在最近报道的3种致病性SPINK1内含子突变的背景下，进一步探索了软件剪接预测和基于细胞的全长基因功能实验的相关性，然后将两者结合为一套流程，验证该流程的有效性和实用性。进一步对在中国和法国CP患者中新发现的一系列SPINK1内含子突变进行功能分类。　　结果：　　1、对52个遗传原因不明的中国CP患者靶向测序SPINK1基因的整个内含子序列，鉴定出16个深度内含子突变。　　2、采用＞5％的次要等位基因频率过滤群体频率，16个深度内含子突变中的6个被分类为非致病性。对剩余的10个深度内含子突变和5个法国CP中发现的罕见的近端内含子突变进行软件预测，发现只有一个近端内含子突变c.194+5 G＞A可能对剪接位点选择有影响。　　3、细胞功能实验显示，c.194+5G＞A突变导致其异常转录本发生了外显子3跳跃，而其正常转录本量较少，其余内含子突变均为非致病性突变。　　结论：　　1、本研究对中国CP人群SPINK1内含子区域进行了大规模的筛查，发现了新的内含子突变并探究了其功能。　　2、该研究提出一种将软件预测与基于细胞培养的全长基因功能实验相结合的操作流程，用于在临床诊断中对SPINK1内含子突变进行功能分类。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一部分我国慢性胰腺炎主要致病基因型及其对临床病程的影响

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、结果

五、讨论

六、结论

第二部分我国慢性胰腺炎主要致病基因SPINK1内含子突变的筛选及其功能分析

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、结果

五、讨论

六、结论

参考文献

综述

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