环糊精糖基转移酶分子改造、产物特异性及其酶学性质研究

摘要

环糊精糖基转移酶(CGTase)是一种多功能酶，可以催化多聚糖分子内的转糖基作用，即环化反应，也能参与偶合反应、水解反应、歧化反应等分子间的转糖基作用。通过环化反应催化淀粉及相关基质生成环糊精是其产业应用的基础，最常见的是生产α-、β-、γ-环糊精。环糊精具有外部亲水内腔疏水的特点，能够包含客体分子从而改变其物理化学性质，如增加溶解性和稳定性，在食品、化妆品、医药、环境保护等方面具有重要作用。而作为生产环糊精的关键酶，CGTase越来越引起人们的重视。
　　目前已有的CGTase催化产物都是α-、β-、γ-环糊精的混合物，较差的产物特异性对单一环糊精的产率及后续纯化分离造成不利影响。因此，借助基因工程手段对CGTase进行定点突变改善CGTase的产物特异性成为重要研究方向之一。针对上述问题，本文以前期构建的含有重组质粒pET22b/cgt为基础，对CGTase关键氨基酸序列进行饱和突变，分析氨基酸与CGTase产物特异性之间的内在联系，主要结果如下:
　　通过多重序列对比及相关文献分析，发现来源于蜡状芽孢杆菌的CGTase43位氨基酸对CGTase产物特异性具有重要作用。实验中以构建的重组质粒pET22b/cgt为模板，采用全质粒的突变方法对43位组氨酸进行饱和突变，将酶解过后的PCR产物转进大肠杆菌DMT中，在含有100μg/mL的LB平板筛选得到阳性克隆菌株，成功构建突变株H43P、H43Q、H43L、H43I、H43F、H43K、H43A、H43C、H43Y、H43E、H43N、H43R、H43S、H43T、 H43G、 H43M、 H43W;
　　以1CXK作为模板，采用同源建模的方式构建了来源于Bacillus cereus的CGTase的空间结构，并用分子动力学软件对模建的结构进行优化获得了可靠的蛋白质三维模型。通过与麦芽九糖抑制剂的分子对接，分析了底物结合凹槽处的相关情况，对-3亚位点及43位氨基酸做出分析;
　　通过定点突变技术将43位的组氨酸突变成苯丙氨酸(H43F)、酪氨酸(H43Y)和色氨酸(H43W)后，CGTase酶活力从6570 U/mL提高到6667U/mL、7814U/mL、15609U/mL，说明含有芳香环的氨基酸有利于提升CGTase降解玉米淀粉的能力;大部分氨基酸代替CGTase43位的组氨酸后，β-CD在产物中所占比例减小，而γ-CD比例增加。用残基侧链短的氨基酸代替原有位置的组氨酸，如H43P、H43A、H43G突变酶的催化产物中γ-CD所占比率为30.2％、28.3％、28.1％，其中原始酶组γ-CD占20％;用疏水性强的亮氨酸和异亮氨酸代替组氨酸后，H43I、H43L突变酶催化产物中γ-CD所占比率为28.4％和28.0％;另外H43T突变酶催化产物中γ-CD所占比率为29.2％;
　　对γ-CD特异性最好的H43P、H43I、H43T突变酶进行酶学性质分析，发现与原始酶性质相似，突变酶的最适温度为60℃，最适pH为9.0，pH在6.0到9.0区间内保持稳定，但是H43P、H43I突变酶的热稳定性比原始酶更好，80℃时仍然有60％、62％的残存活力;酶的动力学性质方面，H43P突变酶的Km值变小，H43I和H43T突变酶的Km变大，说明H43P突变酶与可溶性淀粉的亲和力变强，使得H43P作用于玉米淀粉生成γ-CD的催化效率比原始酶高14.8％。

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致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 环糊精概述

1．1．1 环糊精简介

1．1．2 环糊精结构

1．1．3 环糊精性质

1．1．4 环糊精的应用

1．2 环糊精糖基转移酶概述

1．2．1 环糊精糖基转移酶结构

1．2．2 环糊精糖基转移酶的催化作用

1．2．3 环糊精糖基转移酶与底物结合

1．2．4 环糊精葡萄糖基转移性质

1．2．5 环糊精糖基转移酶产物特异性

1．3 本论文的主要研究内容

第二章 环糊精葡萄糖基转移酶基因的定点突变

2．1 引言

2．2 实验仪器及材料

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 质粒与菌株

2．2．4 培养基

2．2．5 相关溶液的配制

2．3 实验方法

2．3．1 基因突变方法

2．3．2 引物设计

2．3．3 重组质粒提取

2．3．4 E.coli DMT感受态制各

2．3．5 PCR扩增

2．3．6 PCR产物消化

2．3．7 转化

2．4 结果与分析

2．4．1 Bacillus cereus CGTase 43位氨基酸的重要作用

2．4．2 突变基因的获得

2．4．3 突变体测序结果分析

2．5 小结

第三章 环糊精糖基转移酶的同源建模与分子对接

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 供试材料

3．2．2 生物信息数据库和软件

3．3 实验过程

3．3．1 环糊精糖基转移酶信号肽分析

3．3．2 构建modeller序列文件

3．3．3 搜索建模模板

3．3．4 模板序列和目标序列联配

3．3．5 模型的构建

3．3．5 评价模型

3．4 模型优化

3．4．1 RMSD分析

3．4．2 蛋白质量评估

3．5 分子对接

3．5．1 受体蛋白和配体分子的准备

3．5．2 准备配体和受体的坐标文件

3．5．3 AutoDock Vina进行对接

3．6 小结

第四章 环糊精糖基转移酶突变基因表达及专一性分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 质粒与菌株

4．2．4 培养基及抗生素

4．2．5 相关溶液的配制

4．3 实验方法

4．3．1 重组质粒的转化

4．3．2 突变体重组蛋白的表达

4．3．3 蛋白质电泳检测

4．3．4 酶活检测

4．4 结果与讨论

4．4．1 突变酶的表达

4．4．2 定点突变对CGTase酶活的影响

4．4．3 突变酶对环糊精特异性的影响

4．4．4 突变酶对环糊精产量的影响

4．5 小结

第五章 突变酶的纯化和酶学性质

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 主要仪器

5．2．2 主要试剂

5．2．3 相关溶液的配制

5．3 实验方法

5．3．1 突变酶的分离纯化

5．3．2 SDS-PAGE凝胶电泳

5．3．3 突变酶的最适温度

5．3．4 突变酶的最适pH

5．3．5 突变酶的温度稳定性

5．3．6 突变酶的pH稳定性

5．3．7 动力学测定

5．4 结果与讨论

5．4．1 Sephadex G-100凝胶柱层析

5．4．2 突变酶的纯化结果

5．4．3 SDS-PAGE凝胶电泳

5．4．4 温度对突变酶活力的影响

5．4．5 温度对突变酶稳定性的影响

5．4．6 pH对突变酶活力的影响

5．4．7 pH对突变酶稳定性的影响

5．4．8 突变酶反应动力学的研究

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文