单一及混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料对小鼠润肠通便作用的影响

摘要

益生菌抑制病原微生物的能力及在肠道中粘附定植能力，是益生菌改善肠道功能特性的基础。本试验以实验室分离保藏的6株乳酸菌为研究对象，分析单一及混合乳酸菌的抑菌能力和对小鼠肠上皮细胞粘附能力，以及单一及混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料对小鼠润肠通便作用的影响。主要研究结果如下:　　(1)单一及混合乳酸菌发酵对抑菌性影响。采用由实验室前期分离保藏的6株乳酸菌，分别为1株嗜酸乳杆菌（Lactobacillus cidophilus）ss，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）s7，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)grx19，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)g9，动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）BLC和嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)90-57，研究单一及按1∶1∶1∶1∶1∶1比例混合乳酸菌对3株革兰氏阳性病原菌和3株革兰氏阴性病原菌抑菌能力。结果表明，混合菌株产酸能力、生长速率及活菌数均高于单菌株。混合菌株发酵上清液对3种革兰氏阳性病原菌，3种革兰氏阴性病原菌均有抑制作用，抑菌谱较宽，比单菌株发酵抑菌范围明显增大。主成分分析表明，混合菌株抑菌效果综合评分为0.62，均高于单菌株。对乳酸菌抑菌有效成分分析，除乳酸外，混合菌株发酵产物中存在较多对热和蛋白酶敏感的抑菌物质，需要在较低pH协同作用下，才能发挥良好的抑菌效果。　　(2)单一及混合乳酸菌发酵对小鼠肠上皮细胞粘附能力的影响。对单一及按1∶1∶1∶1∶1∶1比例混合乳酸菌抑制3株革兰氏阳性病原菌和3株革兰氏阴性病原菌粘附小鼠肠上皮细胞进行研究。乳酸菌表面疏水性、自聚合能力、粘附细胞能力均存在差异显著(P＜0.05)，L.casei g9、L.plantarum s7、混合菌株，其表面疏水性、自聚合能力、粘附力最优。乳酸菌抑制3株革兰氏阳性病原菌和3株革兰氏阴性病原菌对小鼠肠上皮细胞的粘附效果依次是排除抑制、竞争抑制、替代抑制。不同于单菌株仅对部分病原菌具有较好的粘附抑制作用，混合菌株对3株革兰氏阳性病原菌和3株革兰氏阴性病原菌粘附抑制效果均较好，粘附抑制率分别为71.09％、66.04％、61.37％、73.97％、66.97％、68.63％。经胃蛋白酶、胰蛋白酶、氯化锂后，混合菌株与单菌株发酵对细胞的粘附作用存在显著差异(P＜0.05)，混合菌株经胃蛋白酶、胰蛋白酶、氯化锂处理后的相对粘附率分别为48.13％、43.47％、29.18％，低于单菌株组。通过表面蛋白可逆地与细胞壁再次结合试验，混合菌株与表面蛋白孵育后，粘附率提升最大，为45.8％。　　(3)混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料的研制。通过研究发酵温度及时间对混合菌株发酵果蔬乳饮料酸度、活菌数、抑菌功能影响，得出乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料38℃发酵24h表现最高的产酸速率和活菌数，抑菌能力最强。通过单因素试验确定香蕉浆、红薯浆、低聚果糖合适添加量分别为15％、10％、3％;并通过响应曲面优化，得到乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料优化配方为:乳清粉处理物和脱脂乳为发酵基质（含5％乳清粉和3％脱脂乳粉），香蕉浆添加量为15.67g/100g，红薯浆添加量为10.44g/100g，低聚果糖添加量为2.23g/100g。　　(4)混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料润肠通便作用的研究。从首便时间、6h内排黑便粒数、粪便质量，以及小肠墨汁推进率上分析可知，乳酸菌发酵饮料组促进便秘小鼠排便功能要优于阳性对照组，其中乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料组效果最优，其次是乳酸菌混合发酵乳饮料组、g9单菌株发酵果蔬乳饮料组。进一步研究各试验组肠道菌群，受试样品均在不同程度上抑制肠球菌、大肠杆菌的生长繁殖，其中乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料组、乳酸菌混合发酵乳饮料组显著低于模型对照组(P＜0.05)，抑菌效果显著。乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料组、乳酸菌混合发酵乳饮料组、g9单菌株发酵果蔬乳饮料组、阳性对照组小鼠血清NO、AchE含量均有所改善。其中乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料组小鼠血清NO、AchE含量与空白对照组无显著差异(P＞0.05)，能够使便秘小鼠恢复正常水平，说明乳酸菌混合发酵果蔬乳饮料效果最佳。　　(5)单一及混合乳酸菌发酵体外抑菌能力、粘附能力指标与便秘小鼠体内润肠通便指标相关性的研究。试验表明，乳酸菌对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌能力和抑制病原菌粘附细胞的能力与便秘小鼠的排便能力、小肠运动能力、肠球菌数量、肠动力神经递质均存在显著相关性。混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料组、g9单菌株发酵果蔬乳饮料组均能在一定程度上缓解小鼠便秘症状，其中混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料组在促进小鼠排便、抑制肠道病原菌、调节肠动力神经递质上效果最优。

目录

摘要

1 绪论

1．1 益生菌

1．1．1 益生菌的定义

1．1．2 益生菌的种类

1．1．3 益生菌的生理功能

1．2 慢性便秘

1．2．1 慢性便秘概述

1．2．2 慢性便秘成因

1．2．3 慢性便秘危害

1．2．4 慢性便秘治疗进展

1．3 乳酸菌润肠通便的研究

1．3．1 便秘与肠道菌群

1．3．2 乳酸菌润肠通便机制

1．4．1 膳食纤维的定义

1．4．2 膳食纤维润肠通便的机制

1．5 立题意义和主要研究内容

1．5．1 研究目的及意义

1．5．2 研究内容

2 单一及混合乳酸菌发酵的抑菌作用研究

2．1 材料和方法

2．1．1 主要仪器和设备

2．1．2 常用试剂及培养基的配制

2．1．3 试验菌株

2．1．4 乳酸菌发酵上清液的制备

2．1．5 病原菌的活化

2．1．6 试验方法

2．1．7 数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 单一及混合乳酸菌发酵生长特性的测定

2．2．2 单一及混合乳酸菌发酵抑菌能力的测定

2．2．3 单一及混合乳酸菌发酵抑菌能力的主成分分析

2．2．4 单一及混合乳酸菌发酵抑菌成分的研究

2．3 讨论

2．4 小结

3 单一及混合乳酸菌发酵对小鼠肠上皮_eNJg,di附能力的研究

3．1 材料和方法

3．1．1 主要仪器和设备

3．1．2 常用试剂及培养基的配制

3．1．3 试验菌株与细胞

3．1．4 乳酸菌的活化

3．1．5 病原菌的活化

3．1．6 细胞复苏

3．1．7 试验方法

3．1．8 数据统计与分析

3．2 结果与分析

3．2．1 单一及混合乳酸菌发酵对小鼠肠上皮细胞粘附能力的研究、

3．2．2 单一及混合乳酸菌发酵对抑制病原菌粘附小鼠肠上皮细胞的研究

3．2．3 表面蛋白对单一及混合乳酸菌发酵粘附小鼠肠上皮细胞的影响

3．3 讨论

3．4 小结

4 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料的研制

4．1 材料和方法

4．1．1 主要仪器和设备

4．1．3 试验菌株

4．1．4 乳酸菌混合发酵剂制备

4．1．5 试验方法

4．1．6 数据整理和分析

4．2 结果与分析

4．2．1 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料发酵温度的确定

4．2．2 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料发酵时间的确定

4．2．3 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料中香蕉浆、红薯浆、低聚果糖添加量的确定

4．2．4 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料配方的优化

4．2．5 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料贮藏稳定性的研究

4．3 小结

5 混合乳酸菌发酵果蔬乳饮料对便秘小鼠润肠通便功能研究

5．1 材料和方法

5．1．1 主要仪器和设备

5．1．2 常用试剂

5．1．3 试验菌株

5．1．4 试验动物及饲料

5．1．5 乳酸菌混合发酵剂制备

5．1．6 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 受试样品对便秘小鼠生长指标的影响

5．2．2 受试样品对便秘小鼠排便功能的影响

5．2．3 受试样品对便秘小鼠粪便含水量及小肠含水量的影响

5．2．4 受试样品对便秘小鼠小肠运动功能的影响

5．2．4 受试样品对便秘小鼠肠道菌群的影响

5．2．5 小鼠血液神经递质含量分析

5．3 讨论

5．3．1 结果讨论

5．3．2 相关性分析

5．4 小结

6 结论

参考文献

致谢

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