茶叶中β-葡萄糖苷酶基因cDNA克隆与序列分析

摘要

该论文首次从茶叶中克隆出β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列,结果如下:依据茶树叶片生化特点,应用Chomcznski一步法,并作了部分修改,从鲜叶中分离、提取总RNA.利用GenBank中已经登录的其它植物中该酶基因的保守序列,设计一对简并引物,采用RT-PCR技术,从茶树扩增出208bp的cDNA片段.将扩增片段克隆到PMD18-T上进行序列测定和分析,结果表明,此片段核苷酸序列与其他植物β-葡萄糖苷酶基因cDNA相应序列有很好的同源性,推断该PCR特异产物为茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA片段.以此特异片段设计特异引物,采用RACE技术分别获得β-葡萄糖苷酶cDNA3'端581bp和5'端895bp片段,后再依据上述两段序列设计一对引物,扩增出酶的全长序列1475bp.经Blast搜索表明:克隆所得碱基序列和推导的氨基酸序列与已克隆出的小松树、西葫芦拟南芥等植物体内β-葡萄糖苷酶基因的cDNA相应序列有40﹪—60﹪的同源性,因此我们推断扩增所得到的序列为茶树中β-葡萄糖苷酶基因的cDNA.利用分子生物学软件对氨基酸序列和二级结构进行分析和比较.结果表明,该序列的3'-端和5'端的非编码序列长度分别为189bp和233bp,开放阅读框为1050bp,编码350氨基酸,其转运肽长度为82个氨基酸,成熟蛋白由257个氨基酸组成.经Garnier法预测,茶树β-葡萄糖苷酶蛋白二级结构与其他植物相似,螺旋构象14.33﹪、伸展构象33.81﹪、折叠构象25.43﹪.前体蛋白的分子量为40kDa,等电点(PI)为5.2,为水溶性蛋白.

目录

文摘

英文文摘

引言

1. β-葡萄糖苷酶的研究意义

2.β-葡萄糖苷酶的研究进展

3.β-葡萄糖苷酶与茶叶醇系香气

3.1醇系香气前体

4.β-葡萄糖苷酶与茶树病虫害

5.研究内容与技术路线

5.1研究内容

5.2技术路线

材料与方法

1.材料

2.仪器与试剂

2.1主要仪器设备

2.2主要试剂

3.方法

3.1 RNA提取和检测

3.2 RT-PCR反应

3.3 RT-PCR产物的克隆及测序

3.4 β-葡萄糖苷酶cDNA的3'/5'RACE反应

3.5 β-葡萄糖苷酶cDNA全序列的扩增

3.6cDNA序列分析和蛋白预测

结果与分析

1.总RNA的提取

2.RT-PCR扩增及其产物的克隆与分析

2.1RT-PCR扩增

2.2特异性片段的连接、转化和酶切鉴定

2.3RT-PCR产物的测序

3.3'/5'RACE扩增

3.1 3'RACE扩增

3.2 5'RACE扩增

4.β-glucosidase基因全长序列的扩增

5.Glc基因序列及其蛋白质生物信息学分析

5.1 Glc基因cDNA全序列分析

5.2预测蛋白的特征分析

5.3 Glc基因系统进化树分析

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附图