两种黄瓜A-半乳糖苷酶基因全长cDNA克隆与序列分析

摘要

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)是广泛存在于高等植物、动物和微生物中的一类重要水解酶。本实验室根据其他物种中α-半乳糖苷酶序列的保守区段，已经克隆了4种黄瓜α-半乳糖苷酶的全长cDNA序列。通过已公布的黄瓜基因组序列，根据同源性分析，发现黄瓜基因组中还存在另两种α-半乳糖苷酶基因。
　　 本论文利用反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RapidamplificationofcDNAends，RACE)技术克隆了这两种酶的cDNA全长，分别命名为:黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅲ和黄瓜碱性α-半乳糖苷酶Ⅲ，GenBank登录号分别为JN680267和JQ327828，序列结果表明:黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅲ基因编码430个氨基酸，编码的蛋白质理论分子量为47.9KD。黄瓜碱性α-半乳糖苷酶Ⅲ基因编码783个氨基酸，编码的蛋白质理论分子量为86.1KD。对根据cDNA序列推断出的蛋白质序列分析结果表明，酸性α-半乳糖苷酶Ⅲ蛋白C端存在一段信号肽，将定位于液胞中，而碱性α-半乳糖苷酶Ⅲ则分布于细胞质中。
　　 收集目前GenBank中已发布的高等植物的α-半乳糖苷酶序列，聚类分析结果表明，酸性α-半乳糖苷酶可分为3组，黄瓜的3种酸性α-半乳糖苷酶分属其中的1组;碱性α-半乳糖苷酶分为3组，其中每组均包含黄瓜的1种碱性α-半乳糖苷酶。结合相关报道，对这6组酶的生物学功能进行了总结分析，结果表明:酸性α-半乳糖苷酶第1组可能与果实成熟和叶片发育有关;酸性α-半乳糖苷酶第2组与细胞壁和种子发育过程及植物抗冷性相关;酸性α-半乳糖苷酶第3组在叶片衰老过程中起作用;碱性α-半乳糖苷酶第1组与果实和种子发育及叶片衰老相关;碱性α-半乳糖苷酶第2组与种子发芽、果实水苏糖卸载和干旱胁迫相关;碱性α-半乳糖苷酶第3组与果实和种子发育、叶片衰老和胁迫相关。上述分析为本实验室进一步深入研究黄瓜各种α-半乳糖苷酶的生理功能提供了线索。

目录

摘要

引言

第一章 文献综述

1 α-半乳糖苷酶的简介

1．1 α-半乳糖苷酶的分类

1．2 α-半乳糖苷酶在植物中的功能研究进展

1．3 α-半乳糖苷酶的亚细胞定位

2 cDNA全长的克隆与RACE技术

2．1 全长cDNA文库筛选法

2．2 RACE技术与基因克隆

第二章 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因cDNA片段的克隆

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取的完整性检测

2．2 胶回收产物的PCR验证结果

2．3 重组质粒的PCR验证及测序结果分析

第三章 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因全长cDNA的克隆

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取的完整性检测

2．2 酸性α-半乳糖苷酶5'RACE和3'RACE的结果

2．3 重组质粒巢式PCR的电泳验证结果

2．4 测序结果拼接序列分析

第四章 黄瓜碱性α-半乳糖苷酶cDNA片段的获得

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取的完整性检测

2．2 胶回收产物的PCR验证结果

2．3 重组质粒的PCR验证及测序结果分析

第五章 黄瓜碱性α-半乳糖苷酶基因全长cDNA的克隆

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取的完整性检测

2．2 碱性α-半乳糖苷酶5'RACE和3'RACE的结果

2．3 重组质粒巢式PCR的电泳验证结果

2．4 测序结果拼接与序列分析

第六章 α-半乳糖苷酶的序列分析和分组分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文

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