庚型肝炎病毒基因组全长cDNA克隆及其构建方法

摘要

本发明涉及生物技术领域,是庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的克隆及其构建方法。以覆盖GBV－C/HGV基因组全长cDNA的5个较小的基因片段为起始材料,经过重叠延伸PCR、酶切、连接和转化等,完成GBV－C/HGV基因组全长cDNA的克隆。GBV－C/HGV基因组全长cDNA克隆的成功,为研究GBV－C/HGV的致病性及致病机制、复制及转录和翻译机制、形态及形态发生、基因及血清学特异诊断、核酸及基因工程疫苗和各种动物模型的建立等提供了重要材料。

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的克隆及其构建方法。

1995年，美国有两个研究小组几乎同时分别报道了一种新型肝炎病毒，分别命名为GB病毒C(GBV-C)和庚型肝炎病毒(HGV)，简称为GBV-C/HGV。GBV-C/HGV可经血传播，在商业献血员、血透析患者、静脉药瘾者及乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染者中都有较高的感染率，引起输血后肝炎及其他急、慢性肝病。GBV-C/HGV属于黄病毒科，为单股正链RNA病毒，基因组全长约9.4kb，基因组中仪有一个开放阅读框架(ORF)，结构基因C、E1和E2位于氨基端，编码结构蛋白；非结构基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b位于羧基端，编码非结构蛋白；在开放阅读框的两侧分别为5’非编码区和3’非编码区(图1中方框图所示)。虽然报道的GBV-C/HGV全序列有11株之多，但全序列的读取是根据分段克隆的基因片段的序列，迄今没有具有整体功能的GBV-C/HGV基因组全长cDNA单个克隆。基因片段克隆不能从整体上反映病毒的真正特性，影响了对GBV-C/HGV的深入研究。

本发明的目的是提供GBV-C/HGV基因组全长cDNA的克隆及其构建方法。

本发明构建的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因组全长cDNA克隆包含了GBV-C/HGV基因组从5’非编码区，结构基因C、E1、E2，非结构基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3’非编码区的全长基因。

庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因组全长cDNA克隆的构建，采用重叠延伸PCR拼接基因片段和酶切、连接相结合的方法，包括如下步骤：

(1)合成扩增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；

(2)扩增和拼接GBV-C/HGV基因片段；

(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克隆：

(4)GBV-C/HGV基因组全长cDNA的先隆。

构建GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆的基础材料是含有GBV-C/HGV基因组不同区域基因片段的五个重组质粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3(详见文献：Li Shao et al.Biochem Biophys.Res.Commun1996；228：785-791)。五个同名基因片段从3’至5’端相邻片段互相重叠，覆盖整个基因组(见图1)，其中Iwq2和Iwh6两个基因片段是用长PCR方法从病人血清中扩增而来，Iw5、Iw3’和Iw3基因片段则由5’或3’RACE方法从同一病人血清中扩增而来。

本发明利用重叠延伸PCR(SOEing and PCR)方法，将Iw5和Iwq2基因片段拼接为Iw5-q2基因片段；将Iw3和Iw3基因片段拼接得到Iw3’-3基因片段后，再与Iwh6基因片段拼接获得Iwh6-3基因片段；将Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段。拼接Iwq2-h6基因片段时，要求Iwq2-h6基因片段5’端与Iw5-q2基因片段的3’端互相重叠，且包括共同而且唯一的酶切位点；Iwq2-h6基因片段的3’端与Iwh6-3的5’端互相重叠，同样包括共同且唯一的酶切位点。利用上述酶切位点及在扩增Iw5基因片段的上游引物和扩增Iw3基因片段的下游引物中加入的酶切位点，先进行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，获得重组质粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3。待分段克隆成功后，再以此为基础，利用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法构建GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆pHGVqz。

本发明具有如下优点和积极效果：

本发明采用重叠延伸PCR(SOEing and PCR)拼接、限制性内切酶酶切和连接酶连接基因片段相结合的方法，构建GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆，技术方案构思巧妙。既避免了由数个小基因片段起始、经限制性内切酶酶切、再由连接酶连接的繁杂过程，又因为采用先分段克隆再进行全长基因克隆的途径而降低了实验难度。GBV-C/HGV基因组全长cDNA的克隆成功，为广泛深入地研究该病毒提供了重要实验材料。利用GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆，可以从细胞水平到分子水平，从细胞模型到动物模型，从局部到整体等多方位、多角度地展开对GBV-C/HGV的致病性及致病机制，复制、转录及翻译机制，形态及形态发生等广泛而深入的研究。

附图说明：

图1为本发明中GBV-C/HGV基因组结构及cDNA基因片段的位置，上部的方框图代表GBV-C/HGV基因组结构及各区基因的位置。下部的粗线图及粗线上端的数字代表五个基因片段及其在基因组中的位置。

图2为重组质粒pUC-5-q2的构建流程图。

图3为重组质粒pUC-q2-h6的构建流程图。

图4为重组质粒pGEM-h6-3的构建流程图。

图5为重组质粒pHGVqz的构建流程图。

图2～5中的圆图代表环状质粒，粗线代表基因片段，Yx(x为1-12)代表引物。粗线两端所标数字代表该基因片段在GBV-C/HGV基因组中的位置。

图6 GBV-C/HGV基因组全长cDNA序列

GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆的具体构建方法见如下实施例：

一、合成扩增和拼接基因片段的引物(见表1)，引物的设计及合成参照5个基因片段的大小，同时要尽量满足引物设计的一般条件。

          表1.扩增及拼接GBV-C/HGV基因片段的引物引物        序列(5’-3’)                        引物在基因组中的位置        极性Y1        GCG AAT TCG CGG CCG CCC CCC CCC                1-26                 +

      CGG CAC TGG GTG CAA GC    Y2        AGA GAG ACA TTG AAG GGC GAC                    321-341              -Y3        GAC AGG GTT GGT AGG TCG TAA ATCC               109-133              +Y4        CCG TCC TTG ATG ATG GAA CTG TC                 4399-4421            -Y5        TAT GGG CAT GGC ATA CCC CT                     4261-4280            +Y6        GAG GGC CAC GAT GAT GTT AG                     8696-8715            -Y7        TTC TGC TCC ACT TGG CTC GCT GAGT               8416-8440            +Y8        CTG GAT GCC ACA ACA GGC CCC T                  8881-8902            -Y9        AGG GGC CTG TTG TGG CAT CCAG                   8881-8902            +Y10       GCT CTA GAC TCG AGA ATA AAA CCC    

      GGC CTT TGG GCC G                              9353-9375            -Y11       TTG TTC GAT CAT ATG GGG TCC TTC TCG C          2977-3004            +Y12       GAC CGG AGT CCC TTC AAG TAT CTC CTG G          7737-7764            - 

二、以质粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3为模板，经PCR反应分别扩增5个同名基因片段，PCR反应条件按常规根据预扩增基因片段的长度和所用引物的Tm(解链温度)值进行调整。PCR扩增和拼接反应均应用Expand^TM Long Template PCR系统。

1、Iw5基因片段的扩增(图2)

      (1)Iw5质粒(50ng/ul)              1ul

         10mM dNTP                  1.75ul

         Y1(30uM)                    0.5ul

         Y2(30uM)                    0.5ul

         灭菌重蒸水                21.25ul

         ------------------------------------

      (2)10X缓冲液1                    5ul

DNA聚合酶混合液(3.5单位/ul)          0.75ul

     灭菌重蒸水                     19.25ul先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃30秒.65℃30秒、68℃1分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

2、Iwq2基因片段的扩增(图2，图3)

(1)Iwq2质粒(50ng/ul)                    1ul

   10mM dNTP                         1.75ul

   Y3(30uM)                           0.5ul

   Y4(30uM)                           0.5ul

   灭菌重蒸水                       21.25ul

   ---------------------------------------

(2)10X缓冲液I                           5ul

DNA聚合酶混合液(3.5单位/ul)          0.75ul

   灭菌重蒸水                       19.25ul

先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃ 30秒、65℃ 30秒、68℃ 6分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

3、Iwh6基因片段的扩增(图3，图4)

(1)Iwh6质粒(50ng/ul)                   1ul

   10mM dNTP                        1.75ul

   Y5(30uM)                          0.5ul

   Y6(30uM)                          0.5ul

   灭菌重蒸水                      21.25ul

   ---------------------------------------

(2)10X缓冲液1                          5ul

DNA聚合酶混合液(3.5单位/ul)         0.75ul

   灭菌重蒸水                      19.25ul

先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃ 2分钟预变性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 6分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃ 10分钟。

4、Iw3’基因片段的扩增(图4)

(1)Iw3’质粒(50ng/ul)                  1ul

   10mM dNTP                        1.75ul

   Y7(30uM)                          0.5ul

   Y8(30uM)                          0.5ul

   灭菌重蒸水                      21.25ul

   ---------------------------------------

(2)10X缓冲液1                          5ul

DNA聚合酶混合液(3.5单位/ul)         0.75ul

   灭菌重蒸水                      19.25ul

先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃30秒、60℃ 30秒、68℃1分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

5、Iw3基因段的扩增(图4)

(1)Iw3质粒(50ng/ul)                    1ul

   10mM dNTP                        1.75ul

   Y9(30uM)                          0.5ul

   Y10(30uM)                         0.5ul

   灭菌重蒸水                      21.25ul

   ---------------------------------------

(2)10X缓冲液1                          5ul

DNA聚合酶混合液(3.5单位/ul)         0.75ul

   灭菌重蒸水                      19.25ul先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃ 2分钟预变性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃1分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃ 10分钟。

三、PCR的5个基因片段经琼脂糖凝胶电泳纯化后，分别用DNA聚合酶I大片段(Klenow)处理37℃1小时，去除基因片段3’端存在的“A”(腺嘌呤核苷)。

例：Iw5基因片段的Klenow酶处理(图2)

    Iw5基因片段(0.1ug/ul)             50ul

    10X Klenow缓冲液                  10ul

    Klenow酶(10单位/ul)                1ul

    灭菌重蒸水                        39ul混匀后置37℃1小时，然后酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀。Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3基因片段的Klenow酶处理依照此例进行(图2，图3，图4)。

四、重叠延伸PCR拼接Iw5-q2、Iwq2-h6、Iw3’-3和Iwh6-3基因片段，PCR反应条件根据预拼接基因片段的长度和所用引物的Tm值进行调整。

1、Iw5-q2基因片段的拼接(图2)

(1)经Klenow酶处理后的Iw5基因片段(0.1ug/ul)            2ul

   经Klenow酶处理后的Iw q2基因片段(0.1ug/ul)          2ul

                          10mM dNTP                1.75ul

                          Y1(30uM)                  0.5ul

                          Y4(30uM)                  0.5ul

                          灭菌重蒸水1              8.25ul

                          --------------------------------

(2)                       10X缓冲液1                  5ul

                  聚合酶混合液(3.5单位/ul)         0.75ul

                          灭菌重蒸水              19.25ul先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃30秒、60℃1分钟、68℃6分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

2、Iw3’-3基因片段的拼接(图4)

(1)经Klenow酶处理的Iw3’基因片段(0.1ug/ul)            2ul

   经Klenow酶处理的Iw3基因片段(0.1ug/ul)              2ul

                        10mM dNTP                  1.75ul

                        Y7(30uM)                    0.5ul

                        Y10(30uM)                   0.5ul

                        灭菌重蒸水                18.25ul

(2)                     10X缓冲液1                    5ul

                   聚合酶混合液(3.5单位/ul)        0.75ul

                       灭菌重蒸水                 19.25ul先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃30秒、60℃30秒、68℃2分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

3、Iwh6-3基因片段的拼接(图4)(1)经Klenow酶处理的Iw3’-3基因片段(0.1ug/ul)        2ul   经Klenow酶处理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul)           2ul

                   10mM dNTP                 1.75ul

                   Y5(30uM)                   0.5ul

                   Y10(30uM)                  0.5ul

                   灭菌重蒸水               18.25ul

                   ---------------------------------(2)                   10X缓冲液1                    5ul

           聚合酶混合液(3.5单位/ul)          0.75ul

                  灭菌重蒸水                19.25ul先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃30秒、65℃30秒、68℃6分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

4、Iwq2-h6基因片段的拼接(图3)  (1)经Klcnow酶处理的Iwq2基因片段(0.1ug/ul)         2ul

 经Klenow酶处理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul)         2ul

                        10mM dNTP            1.75ul

                        Y11(30uM)            0.25ul

                        Y12(30uM)             0.5ul

                        灭菌重蒸水          18.25ul

                         --------------------------  (2)                      10X缓冲液1           5ul

             聚合酶混合液(3.5单位/ul)        0.75ul

                       灭菌重蒸水           19.25ul先分别混合(1)(2)中的各成分，然后再将(1)(2)混合，按下述条件进行PCR反应：94℃2分钟预变性，94℃30秒、65℃45秒、68℃6分钟进行35个循环，反应结束前延伸68℃10分钟。

五、将Iw5-q2基因片段经EcoRI+BamHI酶切，回收约3301bp的基因片段，与经EcoRI+BamHI酶切的pUC18载体连接，转化大肠杆菌JM109，酶切鉴定转化子得到重组质粒pUC-5-q2(图2)。Iwq2-h6基因片段经BamHI+SalI酶切，回收约3298bp的基因片段：与经BamHI+SalI酶切的pUC18载体连接，转化大肠杆菌JM109，酶切鉴定转化子得到重组质粒pUC-q2-h6(图3)。Iwh6-3基因片段经SalI+XbaI酶切，回收约2806bp的基因片段，与经SalI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)载体连接，转化大肠杆菌JM109，酶切鉴定转化子得到重组质粒pGEM-h6-3(图4)。

六、将重组质粒pUC-5-q2用EcoRI+BamHI酶切，回收约3301bp的基因片段；pUC-q2-h6用BamHI+SalI酶切，回收约3298bp的基因片段：pGEM-h6-3用SalI+XbaI酶切，回收约2806bp的基因片段。将回收的三个基因片段与经EcoRI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)载体相连接，转化大肠杆菌JMI09，挑取转化子进行酶切鉴定，初步确定克隆GBV-C/HGV基因组全长cDNA的重组质粒pHGVqz(图5)。

GBV-C/HGV全长基因片段与载体的连接：

        pGEM-3Zf(+)/EcoRI+XbaI        (0.1ug/ul)

               5-q2/EcoRI+BamHI        (50ng/ul)

               q2-h6/BamHI+SalI        (25ng/ul)

               h6-3/SalI+XbaI          (60ng/ul)

               10X连接酶缓冲液             1.5ul

               连接酶(5u/ul)                 1ul

               灭菌重蒸水                  3.5ul混匀后14℃过夜。次日取连接物的三分之一进行转化。

七、提取pHGVqz质粒进行核苷酸序列测定。GBV-C/HGV基因组全长cDNA序列长9373bp(图6)，与报道的GBV-C/HGV序列高度同源，但部分核苷酸发生了改变，结果表明，我们已成功地构建了GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆。

GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆的成功，为深入研究该病毒提供了重要实验材料。以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础可以进行多方面的研究，例如：

(一)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础在原核、真核(含昆虫)细胞系统进行基因表达。

(二)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行基因检测、抗原检测和抗体检测研究。

(三)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行有关GBV-C/HGV在体外细胞系统的复制、转录及翻译机制、病毒形态及形态发生研究。

(四)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行致病性与免疫性研究。

(五)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行基因治疗、反义核酸治疗及生物(多肽)药物研究。

(六)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行核酸疫苗、重组基因工程疫苗及疫苗免疫研究。

(七)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行各种动物感染模型、转基因动物模型及基因敲除动物模型的研究。

(八)以GBV-C/HGV基因组全长cDNA克隆为基础进行肽库及抗体库的构建、筛选研究。