人头皮真皮成纤维细胞来源Muse细胞的获取、鉴定和分化

摘要

目的：
　　1.免疫组化法、免疫荧光染色检测头皮中具有多能性基因的细胞分布。并且分离毛乳头，进行免疫荧光染色。
　　2.通过流式细胞分选仪（Fluorescence-activated cell sorter，FACS）分选人头皮真皮成纤维细胞中抗 SSEA3抗体阳性的细胞，获得应激耐受多系分化细胞(multilineage-differentiating stress-enduring cell），即Muse细胞，进行多能性鉴定。
　　3.检测Muse细胞分化为黑素细胞、成骨细胞、肝细胞的能力，检测Muse细胞培养液对成纤维细胞增殖的影响，探讨可能的原因。
　　方法：
　　1.获取正常成年人的头皮标本，常规石蜡切片，进行SSEA3、Oct4、Sox2、Nanog、nestin免疫组化染色；同时对头皮标本进行冰冻切片，采用SSEA3和CD34免疫荧光染色。对体外培养的人毛乳头细胞进行SSEA3、CD34、α-SMA免疫荧光染色。
　　2.采用FACS，从培养的头皮来源的真皮成纤维细胞，分选出抗SSEA-3抗体阳性的细胞（Muse细胞）；进行碱性磷酸酶染色，用免疫荧光染色、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）及Western-blot检测其多能性。用携带Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2的慢病毒转染Muse细胞，获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）样克隆。
　　3.通过添加不同的培养成份，诱导Muse细胞分别分化为：黑素细胞、成骨细胞、肝细胞。CCK8试剂盒检测Muse细胞的培养液对成纤维细胞的增殖影响。RT-PCR检测Muse细胞HGF、IGF基因的mRNA表达。
　　结果：
　　1.免疫组化染色结果显示：在正常人的头皮标本中，SSEA3阳性细胞分布于小汗腺、血管内皮、皮脂腺、毛乳头、外毛根鞘；少量Oct4阳性细胞分布于外毛根鞘、小汗腺、血管内皮；少数Sox2阳性细胞分布于小汗腺、毛乳头及外毛根鞘；少量nestin阳性细胞分布在小汗腺、血管内皮、生长期毛乳头中；Nanog染色显示阴性。免疫荧光染色结果显示：SSEA3分布在小汗腺、外毛根鞘、毛乳头，CD34主要分布在外毛根鞘、毛乳头。部分体外培养的人毛乳头细胞表达SSEA3、CD34。
　　2.用FACS成功分选出SSEA-3阳性细胞（Muse细胞）。将分选出的细胞在2-羟乙基甲基丙烯酸脂(2-hydroxethyl methacrylate，Poly-HEMA）包被板中培养，采用甲基纤维素（Methylcellulose，MC）培养基，使之能悬浮生长，经过7～10天的生长，细胞成簇（Muse细胞簇），且直径达到最大。为了进一步扩增细胞，将悬浮生长的Muse细胞簇进行贴壁培养，可见细胞簇周边细胞放射状生长，光学显微镜下，细胞呈纺锤形。扩增后的Muse细胞再次悬浮培养，获得新Muse细胞簇，如此循环几次，获得大量的Muse细胞，用于多能性检测和诱导分化的研究。Muse细胞/Muse细胞簇对碱性磷酸酶染色显示阳性，即细胞呈紫红色，在细胞簇中央，染色更深。SSEA-3、Nanog、Sox2、Oct4阳性表达。经携带Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2的慢病毒转染Muse细胞，获得iPSC样克隆，该克隆在荧光显微镜下呈现为绿色团块，表明转染成功。Muse细胞转染为iPSC的效率约为0.03％，高于亲本成纤维细胞（fibroblast cell，FC）的转染效率。RT-PCR结果显示：在Muse细胞以及Muse细胞形成的iPSC中，Oct4、Sox2、Nanog、hKlf4的基因表达均显著高于亲本成纤维细胞。并且，iPSC的Sox2、Oct4、hKlf4基因表达也比Muse细胞的高。Western-blot结果显示：Muse细胞及iPSC的Sox2、Oct4、Nanog蛋白的表达量高于亲本FC。
　　3.体外诱导Muse细胞可分化为黑素细胞，并经HMB45、TYR免疫荧光染色证实。同时，将Muse细胞诱导分化为成骨细胞、肝细胞，诱导后细胞均进行特异性标记的免疫荧光鉴定证实。培养Muse细胞3天的培养液，以1：1的比例添加到FC培养基中，促进FC的增殖。
　　结论：
　　1.正常人头皮组织的免疫组化及免疫荧光检测显示：表达多能性因子的细胞集中于毛乳头、外毛根鞘、血管内皮、小汗腺等部位。部分体外培养的毛乳头细胞表达CD34和SSEA3。
　　2.原代培养的头皮来源的真皮成纤维细胞，经FACS可以获得SSEA-3阳性的Muse细胞，这些细胞具有多能性及自我更新能力，转染Muse细胞为iPSC的效率比亲本FC高。
　　3. Muse细胞可以诱导分化为黑素细胞、成骨细胞、肝细胞。Muse细胞培养液可以促进体外培养的FC增殖。

目录

声明

研究背景

组织工程和干细胞

Muse细胞的发现和特征

Muse细胞在临床上的应用前景

我们研究团队的既往研究成果和本次研究的内容

参考文献

第一章 检测头皮及毛乳头中多能性基因的分布

一、材料与仪器

二、方法

三、实验结果与分析

四、 讨 论

五、小 结

参考文献

第二章 流式细胞仪分选抗SSEA-3阳性的头皮真皮成纤维细胞，获得Muse细胞，鉴定其多能性。

一、材料与仪器

二、方法

三、 结 果

四、讨 论

五、小结

参考文献

第三章 Muse细胞的三系分化潜能

一、材料与仪器

二、方法

三、结 果

四 讨 论

五、小结

参考文献

附录 第四章 对胎儿头皮来源细胞的Oct4单因子转染研究

一、材料、试剂与设备

二、实验方法

三、结 果

四、讨 论

参考文献

总结和展望

总结

展望

第五章 综 述

综述1:Muse细胞与相关皮肤病研究进展

综述2:毛囊免疫赦免与相关皮肤病研究进展

第六章 病例报告

参与科研项目：

读博期间以第一作者发表的论文

缩写词表

致谢