真皮成纤维细胞多向分化能力鉴定及成骨潜能亚群细胞的纯化研究

摘要

目的：
　　定量比较FBs、ADSCs和BMSCs的体外增殖能力、多向分化能力和膜表面蛋白表达谱差异,评价FBs能否作为构建同种异体组织工程种子细胞库的细胞来源;依据BMPR表达情况,从真皮中分选出不同细胞亚群,比较不同亚群细胞之间成骨能力差异,确定成骨分化潜能细胞亚群的特异性分子标志。
　　方法：
　　细胞增殖能力评价:测定细胞平均倍增时间和累积分裂次数。成脂分化能力评价:计数脂滴阳性细胞比例;采用realtime PCR定量测定成脂分化特异性基因Leptin和PPAR-Y mRNA表达量。成软骨分化能力评价:定量测定成软骨分化特异性基因Aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达量。成骨分化能力评价:碱性磷酸酶(AP)染色及活性测定和形成钙结节计数;定量测定成骨分化特异性基因AP和骨钙素(OCN)mRNA表达量。流式细胞仪分析细胞膜表面间充质干细胞相关膜蛋白(CD90、CD105、CD73和CD34.)和BMPR各亚型(BMPR-Ⅰ A、BMPR-Ⅰ B和BMPR-Ⅱ)的表达。免疫磁珠分选BMPR阳性细胞并分别进行成骨能力定量比较。
　　结果：
　　与ADSCs和BMSCs相比,FBs组细胞累积分裂次数最多,细胞倍增时间最少;成脂诱导条件下,FBs组形成脂滴阳性细胞比例最低(p＜0.05),Leptin和PPAR-γ mRNA表达量最低(p＜0.05);成软骨诱导条件下,FBs组Aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达量最低(p＜0.05);成骨诱导条件下,FBs组AP活性和形成钙结节数量最低(p＜0.05),AP和OCN mRNA表达量最低(p＜0.05)。三种细胞膜表面蛋白表达谱相似,但FBs膜表面BMPRIB表达率为17.5±0.35％,高于后两者。成骨诱导条件下,真皮中BMPRIB+细胞亚群AP活性、钙结节计数和AP和OCN mRNA表达量均高于BMPRIB细胞亚群(p＜0.05)。
　　结论：
　　FBs、ADSCs和BMSCs三种细胞膜表面蛋白表达谱相似、体外扩增能力强,且均具有多向分化能力。但与ADSCs和BMSCs相比,FBs表现出最强的体外增殖能力,最弱的体外成脂、成软骨和成骨分化能力。未分选的FBs不是构建组织工程种子细胞库的最佳细胞来源。
　　通过BMPRIB特异性抗体,可以从真皮中分选出两类细胞亚群。它们体外增殖能力相似,但BMPRIB+细胞亚群成骨分化能力明显强于BMPRIB-细胞亚群。通过细胞膜表面:BMPRIB可能有助于我们从混合性真皮成纤维细胞群体中筛选并纯化出成骨潜能亚群细胞。