用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白

摘要

本发明涉及用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白，其采用以下步骤获得：真皮来源细胞经体外培养、扩增，并经稀释和96孔板培养，获取若干单克隆细胞；对上述所得的单克隆细胞进行成脂肪、成骨及成神经体外诱导，并鉴定其分化能力；分别对双向克隆细胞和三向克隆细胞分离提纯，获得相应的膜蛋白组分；通过双向电泳分析，找出三向克隆和双向克隆的差异蛋白点；进行LTQ质谱分析，获得匹配的蛋白质；通过Western-Blot检测，找出标志膜蛋白。本发明还涉及所述的标志膜蛋白的用途，经上述方法初步筛选出的随着分化能力的变化而出现较明显上调或下调的标志膜蛋白，可用于具有多向分化潜能细胞的分选纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种标志膜蛋白，具体地，涉及用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白。

背景技术

干细胞在细胞治疗、基因治疗以及组织工程等方面的广泛应用前景，使其成为近年来生命科学领域研究的热点。而成体干细胞因不涉及医学伦理问题，同时具有多向分化潜能以及自体取材等优点，更是该领域的研究焦点。目前已从骨髓、脂肪、肌肉等多种组织内分离获得了具有不同分化能力的成体干细胞，部分细胞(如骨髓基质干细胞)已成功用于组织和器官缺损的修复。

皮肤是人体表面积最大的器官，细胞资源丰富，而且位置表浅、易于取材。近来研究表明，真皮内同样存在具有多向分化潜能的细胞(skin-derivedprecursors，以下简称SKPs)。SKPs能在特殊的培养液内悬浮生长及长期传代培养(可体外培养1年以上)；体外培养时能聚集生长，表达神经干细胞的标志物巢蛋白(nestin)，不表达波形蛋白(vimentin)。SKPs能够向多种神经细胞，如神经元、神经胶质进行细胞分化；不仅如此，SKPs还能向部分中胚层细胞，如脂肪细胞及平滑肌细胞分化。虽然SKPs在皮肤内的具体分布及根本作用尚未被彻底了解，但是它所具有的多胚层(神经外胚层及中胚层)分化及自我更新能力，均说明其为皮肤来源的成体干细胞。

经大量研究发现，真皮内的主要细胞群体——成纤维细胞内存在同时向中胚层、内胚层及外胚层分化的细胞，即多潜能真皮成纤维细胞(MultipotentDermal Fibroblasts，以下简称MDFs)。MDFs能在常规的贴壁生长和长期传代培养，表达多种间充质干细胞的标志物，如Vimentin、CD105、CD49d、CD29、STRO-1等，不表达CD34、CD133等造血干细胞的标志物；体外多向诱导后能同时向成骨-成软骨-成脂肪方向分化。对MDFs的单细胞克隆进行研究后发现，大部分克隆均能在体外长期传代培养，其染色体均未出现异常；体外诱导实验显示约6.4％的克隆具有成骨-成软骨-成脂肪的三向分化能力，19.2％的克隆具有双向分化能力。值得一提的是，部分MDFs克隆甚至表现出跨胚层分化的潜能，如向神经外胚层和内胚层(肝细胞)分化。

MDFs的扩增和多向分化能力提示了其潜在的临床应用价值。然而，该细胞的含量很低，如果不进行细胞分选，其中夹杂的大量无分化能力细胞将影响疗效。为此，找到能用于分选纯化的特异性标志物是关键。流式细胞分析是常用的细胞表面标志物研究方法，如在骨髓基质干细胞研究中，可通过流式细胞分析多种表面标志物(Marker)：SH2(CD105)、SH3(CD71)、CD29等的表达。但该方法只能检测一些已知的细胞表面分子，具有一定的局限性。基于分子水平的芯片技术为干细胞Marker的寻找提供了新的手段；这些技术可通过全面系统地比较两种细胞群体的基因表达差异，从中发现与多向分化潜能有关的基因，找到有效的干细胞Marker。但通过这些技术分析往往会得到庞大的数据量；因此，找到能有效筛选真皮内的MDFs的标志物(Marker)是面临的主要问题。

发明内容

本发明提供了用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白，该标志膜蛋白可作为分选、纯化、富集多分化潜能细胞的Marker，直接用于进行真皮内的多向分化潜能活细胞的分选。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白，该标志膜蛋白由以下步骤获得：

步骤1，真皮来源细胞经体外培养、扩增，并经包括(但不仅限于)有限稀释法稀释和96孔板培养等方法在内的步骤，获取若干单克隆细胞；

步骤2，对上述步骤1得到的单克隆细胞进行多向诱导，包括但不仅限于成脂肪、成骨及成神经体外诱导，并鉴定其分化能力；

步骤3，以膜蛋白提取液分别提纯双向克隆细胞和三向克隆细胞，获得相应的膜蛋白组分；

步骤4，对上述步骤3获得的膜蛋白，通过双向电泳分析，找出三向克隆和双向克隆的差异蛋白点；

步骤5，通过质谱分析，获得与上述的差异蛋白点相匹配的蛋白质结果；

步骤6，通过Western-Blot法检测上述匹配的蛋白质，找出呈现阳性的差异膜蛋白。

进一步地，所述的步骤2中鉴定细胞分化能力的方法包含：细胞外型观测，察看细胞外型是否呈现多触角样变化。

所述的步骤2中鉴定细胞分化能力的方法还包含：免疫细胞化学检测，通过免疫细胞染色，检测细胞是否表达神经降压素受体-3。

所述的步骤3还包括Bradford法检测提取液中的膜蛋白浓度。

所述的步骤4还包括双向电泳分离步骤：

步骤4.1，依据所述的膜蛋白的等电点不同，在PH梯度胶内进行等电聚焦；

步骤4.2，根据它们相对分子量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离，从而获得二维的蛋白质分离图谱。

所述的用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白包含：ANXA2膜联蛋白A2、PHB阻抑素及PDIA3人蛋白二硫化物异构酶A3。

所述的用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白的用于筛选真皮内多向分化潜能细胞的用途。

本发明以膜蛋白组学技术分离膜蛋白与非膜蛋白，对细胞膜蛋白采用双向(2-D)电泳分离技术进行分离，并根据2-D电泳及液相-质谱联合分析结果，经过Western-Blot鉴定，获得三种比较有意义的膜表达差异较显著的蛋白质：膜联蛋白A2(ANXA2，Annexin A2 isoform 1)、阻抑素(PHB，Prohibitin)、人蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3，Protein disulfide-isomerase A3)。

膜蛋白组学技术可通过分离膜蛋白与非膜蛋白的方法，选择性地比较膜蛋白的差异，缩小研究范围，有利于筛选。为进一步缩小差异，选择合适的对比细胞将是其关键。原则上，所选择的两群细胞越接近，所得到的差异表达就越少，就能更大限度地缩小差异范围。理论上，多向分化克隆与双向分化克隆之间的差异最接近，因此，比较这两群细胞之间的差异，将能得到与MDFs多向分化能力有关的差异膜蛋白。

本发明的用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白，是采用膜蛋白组学技术分别分离三向克隆细胞和双向克隆细胞的膜蛋白与非膜蛋白，并采用双向(2-D)电泳分离技术对得到的膜蛋白进行分离，并对2-D电泳图谱中的差异蛋白点进一步做LTQ质谱分析及Western Blot法检测，从而初步筛选出随着分化能力的变化而出现较明显上调或下调的差异膜蛋白，该差异膜蛋白可作为分选纯化的特异性标志物，方便进行真皮内具有多向分化能力的MDFs细胞分选。

附图说明

图1为本发明的用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白的三种差异膜蛋白经Western-Blot检测的结果。

具体实施方式

以下分别结合附图及实施例对本发明的实施方式做进一步的说明：

一、MDFs单细胞克隆的体外培养与扩增

人真皮来源细胞经体外培养、扩增；待细胞长至80％融合时，加入0.25％胰酶消化、传代；经过适当代数的体外培养，同样通过胰酶消化，获得真皮来源细胞悬液，经过有限稀释法稀释，将单个细胞加入96孔板内进行培养，每3天更换条件培养液1次，直至形成较大的克隆。通过对单克隆细胞进行进一步的传代培养(前4代)，获得一定数量的单克隆细胞。

二、MDFs的成骨-脂肪-神经三向诱导与鉴定

从上述步骤得到的人MDFs单克隆细胞中随机挑选其中12个单细胞克隆(其中一个单细胞克隆在传代过程中出现污染)，经体外适当传代、扩增，分别进行成骨诱导、成脂肪诱导及成神经诱导。

成脂肪及成骨诱导方法详见文献：Pittenger，M.F.Mackay A.M.，BeckS.C.，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999，284：143-147。

成神经诱导步骤如下：将上述的单细胞克隆以低密度接种在事先用纤维蛋白FN(10ng/ml)铺层过的六孔板上，加DMEM培养液(含有20％胎牛血清蛋白FBS、100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素)培养24小时；然后换成神经预诱导液(DMEM-HG培养液，其中含有20％FBS、10ng/ml成纤维细胞生长因子β，即β-FGF)，继续培养24小时；细胞经磷酸盐缓冲液PBS充分洗涤，继而以成神经初步诱导液(DMEM-HG培养液，其中含有1mM β-巯基乙醇、10ng/ml NT-3)继续培养2天；最终换成成神经诱导液(DMEM-HG培养液，其中含有10ng/ml神经营养素-3NT-3、10ng/ml神经生长因子NGF、50ng/ml脑源性神经营养因子BDNF)培养3-7天。

实验结果：成骨诱导4周后，克隆细胞生长区出现钙化结节；体外成脂肪诱导2周，细胞内开始出现脂滴，成脂肪诱导3周后，含脂滴的细胞数量明显增多，经油红(Oil Red)染色后呈现空泡样结构；经成骨-成脂肪诱导，9个克隆具有成骨-成脂肪诱导潜能；1个仅存在成骨诱导能力，1个无成骨、成脂肪能力。

所有成骨-成脂肪双向克隆均同时进行成神经诱导，结果显示，其中2个克隆在体外成神经诱导过程中，细胞外型呈现多触角样变化，免疫细胞染色显示，细胞表达神经降压素受体-3(NTR-3)，呈现神经细胞的特征；而无成神经潜能的成骨-成脂肪双向克隆，在经过体外成神经诱导后，细胞形态改变较少，不表达神经降压素受体-3。成神经诱导后，通过细胞外型观测及免疫细胞化学(NTR)检测，可鉴定MDFs的三向分化能力。

三、MDFs三向克隆与双向克隆的膜蛋白分离

分别取对数生长期、生长状态良好的MDFs双向克隆和三向克隆细胞各2×10⁷，加入0.01mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA和0.01mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF(以防止蛋白降解)，以膜蛋白提取液(Native Membrane ProteinExtraction Kit，Calbiochem，444810)裂解、提纯，最终获得膜蛋白组分；经5K超滤浓缩，Bradford法(Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate500-0006；Protein Standard I Bovine Gamma Globulin 500-0007)检测膜蛋白浓度。

Bradford法，即1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法：首次使用的液态试剂按说明操作，先行检测并制作标准曲线(两次使用间隔超过两个月，同样需重新做标准曲线)。检测过程简介如下：配制溶液(20mg考马斯亮蓝，即G250，10ml 95％乙醇，20ml 85％磷酸，溶解后加水定量至200ml)后，将标准蛋白溶解于水中(1mg/ml)，并于-20℃保存。继而，进行以下定量用：取7个试管，加入5ml定量溶液；分别在试管中加入0μl，10μl，20μl，40μl，60μl，80μl，100μl标准蛋白溶液；再分别加水至100μl；室温静置5分钟后，于1小时内测定吸光值；分光光度计预热15分钟后读数；定量管每管读取3次，取平均值。进而，制作标准曲线；定量时样品取总量在10μg～100μg；然后根据标准曲线计算样品浓度。

四、MDFs膜蛋白的双向电泳分析

分别取以上步骤所获的膜蛋白，进行双向电泳(2-D)分析(各三次重复)。首先，依据目标蛋白质的等电点不同，在PH梯度胶内进行等电聚焦；继而根据它们相对分子量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离，从而获得二维的蛋白质分离图谱；最后进行定量(Bio-Rad protein assay reagent)、分装(100ug)、-80℃低温保存。

双向电泳过程及参数简述如下：上样100ug，取IEF为pH 3～10的非线性胶条(Amersham公司)；电泳条件：30v 12hrs；500v 1hr；1000v 1hr；8000v8hrs；500v 4hrs)；SDS-PAGE采用12.5％的凝胶(15mA/胶30min，30mA/胶)，电泳至溴酚蓝离胶下沿0.5cm。最后进行银染、扫描，获得图谱。所获图谱均经PDQUEST软件进行差异分析，并以红色标记点标出22个较明显的三向克隆和两向克隆的差异蛋白点。

五、MDFs膜蛋白LTQ质谱分析

挑取上述电泳图谱中10个清晰明显的差异蛋白点进行做LTQ(linear iontrap quadrupole)质谱分析，简介如下：采用常用腐肉胰酶(Trypsin)胶内酶解20个小时，抽提酶解肽段，电喷雾质谱(ESI质谱)检测，进行质谱数据采集：多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集——每次全扫描(full scan)后采集十个碎片图谱(MS2 scan)。最后进行数据分析：原始文件(raw file)用蛋白质测定BIOWORKS软件搜索ipi.HUMAN.v3.53.数据库，最后获得匹配的蛋白质结果(见表1)。

表1差异蛋白点的LTQ鉴定结果

六、初筛膜蛋白的Western-Blot检测

根据搜库结果，选择其中搜库结果可靠性比较高并且相对比较有意义细胞膜相关蛋白(排除非细胞膜成分，如线粒体膜、核膜的蛋白成分)进行Western-Blot检测；此三种蛋白分别是Annexin A2 isoform 1(ANXA2)、Prohibitin(PHB)、Protein disulfide-isomerase A3(PDIA3)。

Western-Blot鉴定的主要试剂包括：兔抗人多克隆抗体ANXA2(sc-11387)；兔抗人多克隆抗体PHB(sc-28259)；兔抗人多克隆抗体PDIA3(sc-28823)；内参照兔抗人GAPDH(sc-47724 37KD)；羊抗兔IgG-HRP试剂盒(北京博奥森生物)；显影液及定影液均为柯达公司生产；ECL(电化学发光免疫测定)发光试剂盒A、B液产自武汉博士得公司；其他试剂均为进口或国产化学分析纯；所用Western blot灌胶模具为Bio-Rad公司生产；分析软件为凝胶定量分析软件Quantity One。鉴定结果显示，所述的三种蛋白均出现阳性结果——三向克隆的浓度明显高于双向克隆(如图1)，而对照组GAPDH的三向克隆的浓度与双向克隆的浓度差别很小。

本发明采用膜蛋白组学技术分离膜蛋白与非膜蛋白，通过对MDFs的多向(多胚层)分化与双向分化克隆的膜蛋白成分进行抽提，然后采用双向(2-D)电泳分离技术对得到的膜蛋白进进行分离，并对2-D电泳图谱中清晰明显的差异蛋白点进一步做LTQ(linear ion trap quadrupole)质谱分析及Western Blot法检测，从而初步筛选出随着分化能力的变化而出现较明显上调或下调的差异膜蛋白，该差异膜蛋白可作为分选纯化富集真皮内具有多向分化潜能细胞的标志膜蛋白，用于进行真皮内具有多向分化能力的MDFs细胞分选

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。