大豆抗氧化多糖制备表征及对辐射诱导氧化应激抑制作用

摘要

随着核技术的广泛应用，辐射伤害已渗透到各个领域。电离辐射产生过量的活性氧簇（ROS），攻击生命大分子，所引发的氧化应激与人类近百余种疾病密切相关。电离辐射导致的氧化损伤越来越受到人们的重视，筛选具有强抗氧化活性的天然产物成分已成为医学、生物学和食品科学研究的热点。本课题以大豆抗氧化多糖（Polysaccharides from soybean residue，SRP）为研究对象，系统性研究其制备工艺、分离纯化方法、结构表征、抗氧化、抗辐射活性和对辐射诱导氧化应激防护作用机制。
　　采用纤维素酶法降解豆渣制备可溶性 SRP，通过响应面法（RSM）优化得到酶法制备SRP的工艺条件：酶用量60 U/g、pH值5.10、温度50℃，在此条件下，酶解1 h SRP得率为45.71％。通过活性跟踪研究，确定酶解时间8 h SRP具有最佳抗氧化活性。
　　利用DEAE-52阴离子纤维素层析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析对SRP进行纯化，制备得到中性大豆抗氧化多糖SRP-1a。采用HPGPC、GC-MS、FT-IR高碘酸氧化-Smith降解和NMR技术对SRP-1a结构进行表征，研究发现 SRP-1a为均一度较高的多糖，其分子量分布宽度Mw/Mn=1.19，重均分子量为3.89×103 Da。含有核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等7种单糖组分，其摩尔比为0.82:0.97:2.77:0.63:6.38:70.62:17.82。SRP-1a的糖残基构型主要为1,4-β-D-Glcp、1,3,6-α-D-Manp和1,4-α-D-Galp。主链是由Glcp和Manp组成的甘露葡聚糖，(1→)-β-D-Glcp为主链的非还原性末端残基，由1,3,6-α-D-Manp通过O-6位与1,4-α-D-Galp残基构成的侧链相连。
　　通过体外抗氧化筛选模型，研究了SRP-1a清除生理自由基、非生理自由基、总还原能力、金属离子螯合能力和抑制脂质过氧化能力。结果表明，SRP-1a具有较强的传递氢原子能力，可以通过提供氢原子直接清除羟基自由基（·OH）或终止自由基的链反应，从而防止自由基诱导氧化损伤的发生。同时，SRP-1a具有较高的还原能力和金属离子螯合能力，对于脂质过氧化具有一定的抑制作用，并呈良好的剂量效应关系。
　　建立X和60Coγ辐射诱导细胞损伤模型，研究SRP-1a对细胞的保护作用。结果表明，SRP-1a可以拮抗电离辐射损伤作用，提高辐射损伤小鼠脾细胞活力，降低小鼠脾细胞DNA的辐射损伤程度，增加细胞抗氧化酶活性，减少丙二醛（MDA）含量。建立60Coγ辐射诱导氧化损伤动物模型，对SRP-1a的辐射防护作用进行研究。结果表明，SRP-1a能减轻辐射造成小鼠免疫器官的损伤，显著增加小鼠各脏器中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，提高还原型谷胱甘肽（GSH）含量，降低MDA含量，有效激活抗氧化酶系，减少脂质过氧化，减轻细胞膜的氧化损伤，降低小鼠外周血淋巴细胞异形和骨髓细胞微核率。
　　通过免疫组化和蛋白免疫印迹技术（Western blot）对小鼠脾脏、肝脏组织线粒体介导的细胞凋亡信号途径主要相关蛋白表达进行了研究。结果表明，SRP-1a防护辐射诱导机体氧化损伤的作用机制是：SRP-1a通过提高 Bcl-2表达水平，抑制Bax表达的上调，降低胞浆Cyt-c表达，继而降低凋亡酶caspase-3活化片段的表达，起到对辐射诱导细胞过度凋亡的抑制作用。
　　SRP-1a能够改善由电离辐射诱导的氧化损伤，降低活性氧自由基的产生，调节细胞氧化还原和凋亡信号转导，抑制细胞线粒体凋亡信号途径，对辐射诱导氧化伤害具有显著的防护作用。本研究结果对于揭示辐射诱导氧化损伤防护机制及开发研制新型抗辐射药物具有重要的理论价值和应用意义。

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第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究目的和意义

1.2 辐射诱导氧化损伤与防护

1.3 植物多糖研究进展

1.4 大豆多糖研究进展

1.5 本论文的主要研究内容及课题来源

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料与设备

2.2 大豆抗氧化多糖制备与表征方法

2.3 抗氧化活性研究方法

2.4 抑制辐射诱导细胞损伤的研究方法

2.5 对辐射损伤小鼠保护作用研究方法

2.6 对辐射诱导氧化损伤的防护机制研究方法

2.7 统计学处理

第3章 大豆抗氧化多糖制备与结构表征

3.1 引言

3.2 大豆粗纤维的制备工艺

3.3 大豆抗氧化多糖制备工艺优化

3.4 大豆抗氧化多糖的纯化

3.5 SRP-1a结构表征

3.6 本章小结

第4章 SRP-1a氧化应激防护作用体外研究

4.1 引言

4.2 SRP-1a体外抗氧化活性研究

4.3 SRP-1a对正常小鼠脾细胞活力的影响

4.4 SRP-1a对X射线辐射小鼠脾细胞防护作用

4.5 SRP-1a对 60Coγ射线辐射损伤小鼠脾细胞防护作用

4.6 本章小结

第5章 SRP-1a对 60Coγ辐射诱导小鼠氧化损伤防护作用的研究

5.1 引言

5.2 SRP-1a对小鼠体重的影响

5.3 SRP-1a对辐射小鼠氧化应激的影响

5.4 SRP-1a对辐射小鼠免疫器官指数的影响

5.5 SRP-1a对辐射小鼠血象指标的影响

5.6 SRP-1a对辐射小鼠肝脏、脾脏组织形态学变化的影响

5.7 本章小结

第6章 SRP-1a对辐射诱导氧化损伤的防护作用机制

6.1 引言

6.2 SRP-1a对辐射诱导小鼠DNA损伤的影响

6.3 SRP-1a对辐射损伤小鼠脾细胞周期的影响

6.4 SRP-1a对辐射损伤小鼠细胞凋亡的影响

6.5 SRP-1a对细胞线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响

6.6 本章小结

结论

创新点

展 望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢

个人简历