固定化凝乳酶制备酪蛋白糖巨肽的初步研究

摘要

酪蛋白糖巨肽（CaseinGlycomacropeptide，CGMP）是一种由凝乳酶（或胃蛋白酶）水解酪蛋白中κ-casein的Phe105-Met106的肽键得到的具有64个氨基酸残基的短肽。CGMP具有多种生物活性。目前CGMP生产主要是从乳清中提取，由于乳清中乳糖、乳清蛋白等的存在，使大规模生产CGMP存在一定的技术困难。本文研究以酶解干酪素工艺生产CGMP，并对酶解工艺中的凝乳酶进行固定化研究，降低工业成本，同时利用多种方法分离提纯CGMP，获得不同纯度的CGMP的制备工艺。
　　凝乳酶的固定化工艺根据单因素实验结果，采用Minitab软件对影响固定化凝乳酶的主要因素进行了筛选，结果表明加酶总量、固定化时间、戊二醛浓度对凝乳酶固定化有显著影响。根据Minitab的分析结果，采用DesignExpert软件中响应面设计及分析对酶解主因素进行了优化，经软件分析预测优化后，并根据实际条件最终确定戊二醛浓度为13％，酶总量200mg/(g载体)，交联化时间3h，固定化时间50min。
　　对固定化凝乳酶的酶学性质和稳定性进行了测定，其最适温度55℃、最适pH为5.5，具有很好的稳定性。固定化酶活力回收率达到26.59％。通过对固定化酶与游离酶生产CGMP的比较，发现酶解干酪素的上清液中CGMP的含量没有明显差异。可重复使用6次，说明该固定化凝乳酶具有良好的操作稳定性。保存2个月的酶活仍在80％以上，具有很好的工业化应用潜力。
　　在酪蛋白糖巨肽的分离纯化部分，考察了膜过滤分离方法与离子交换层析的最佳条件。结果表明以截留量为5000Da的超滤膜，确定了超滤压力为0.03Mpa，pH值7。筛选出阴离子交换树脂D280对CGMP进行分离纯化，上样量1/10BV，pH为6.5，洗脱流速1BV/h，0.4，0.6，1.0mol/L的NaCl沈脱梯度，各梯度洗脱体积为1.5BV，其中CGMP被洗脱浓度为0.6mol/L的NaCl，酪蛋白糖巨肽的回收率可以达到75.68％。通过不同的分离方法，在确定的最佳条件下，经过喷雾干燥制得3种不同纯度的CGMP样品，根据国家标准，测定样品相关理化指标，并与丹麦样品进行比较。结果表明制的CGMP样品二和三的糖基化度和纯度较高，且符合产品的卫生指标。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 酪蛋白糖巨肽的简介

1．1．1 酪蛋白糖巨肽的肽链结构

1，1．2 酪蛋白糖巨肽的糖链结构

1．1．3 酪蛋白糖巨肽的功能

1．2 酪蛋白糖巨肽国内外研究进展

1．3 酶解法酪蛋白糖巨肽的制备

1．4 固定化酶技术的简介

1．4．1 固定化酶的概述

1．4．2 酶的固定化方法

1．4．3 大孔树脂载体

1．4．4 酶固定化使用的交联剂

1．5 膜分离法用于分离CGMP

1．5．1 超滤膜分离法

1．5．2 中空纤维超滤法

1．6 层析法用于分离CGMP

1．7 本课题的研究意义和研究内容

1．7．1 本课题的研究目的和意义

1．7．2 本课题研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要药品及试剂

2．1．2 主要仪器及设备

2．2 实验方法

2．2．1 凝乳酶酶活力的测定

2．2．2 凝乳酶固定化载体的确定

2．2．3 凝乳酶固定化方法的确定

2．2．4 交联剂浓度对固定化酶活力的影响

2．2．5 加酶量对固定化酶活力的影响

2．2．6 交联化反应时间对固定化酶活力的影响

2．2．7 固定化反应时间对固定化酶活力的影响

2．2．8 固定化pH对固定化酶活力的影响

2．2．9 酶固定化的最佳工艺分析

2．2．10 最适反应温度的测定

2，2．11 最适反应pH的测定

2．2．12 固定化酶的热稳定性研究

2．2．13 固定化酶的pH稳定性

2．2．14 酶活力回收率计算

2．2．15 固定化酶在酶解工艺的应用

2．2．16 固定化酶在酶解工艺的重复利用率

2．2．17 酶解干酪素的条件

2．2．18 固定化酶的保存稳定性

2．2．19 水解液中蛋白含量的测定

2．2．20 水解液中酪蛋白糖巨肽含量的测定

2．2．21 离心与抽滤对CGMP对初步分离纯化

2．2．22 超滤膜浓缩技术对分离纯化的影响

2．2．23 中空纤维膜浓缩技术对分离纯化的影响

2．2．24 离子交换层析在CGMP精制中的应用

2．2．25 CGMP制备与指标的测定

3 结果与讨论

3．1 凝乳酶固定化条件的确定

3．1．1 凝乳酶固定化载体的筛选

3．1．2 凝乳酶固定化方法的确定

3．1．3 交联剂浓度对固定化酶活力的影响

3．1．4 加酶量对固定化酶活力的影响

3．1．5 交联化反应时间对固定化酶活力的影响

3．1．6 固定化反应时间对固定化酶活力的影响

3．1．7 固定化pH对固定化酶活力的影响

3．1．8 酶固定化条件中主要影响因素的筛选

3．1．9 响应面优化凝乳酶固定化实验

3．1．10 验证实验

3．2 固定化凝乳酶酶学-性质的测定

3．2．1 固定化酶最适反应温度

3．2．2 固定化酶的最适反应pH

3．2．3 固定化酶的热稳定性研究

3．2．4 固定化酶的pH稳定性研究

3．2．5 酶活力回收率计算

3．3 固定化酶在酶解制备CGMP中应用

3．3．1 固定化酶与游离酶酶解干酪素成分的比较

3．3．2 固定化酶在酶解工艺中的重复操作稳定性

3．3．3 固定化凝乳酶保存期

3．4 CGMP的分离提纯

3．4．1 标准曲线的绘制

3．4．2 离心与抽滤对CGMP对初步分离纯化的影响

3．4．3 膜分离技术对分离纯化的影响

3．4．4 离子交换层析在CGMP纯化中的应用

3．4．5 产品鉴定

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士期间发表论文情况

致谢