金华及其周边地区红曲中红曲菌种类和红曲色素的研究

摘要

红曲(Semen Oryzae Cum Monas)中文别名红曲、红大米、红糟等，在我国的生产和使用已有一千多年历史，为真菌门，子囊菌纲，真子囊菌亚纲，红曲霉属。古籍中对它的特殊功效及在食品上的应用早有记载。《本草纲目》:“红曲主治消食活血，健脾燥胃。治赤白痢，下水谷，跌打扑伤损，治女人血气痛及产后恶露不尽。”而近代中医药理论把红曲的药用功能主要概括为“除湿痰，化血化瘀，健脾消食”，“治赤白痢，下水谷”等几点。红曲根据用途可以分为色曲、轻曲、库曲。色曲用于食品着色;轻曲用于腐乳、果酒、药酒、酱菜及食品着色;库曲主要酿制黄酒、果酒和药酒。红曲霉能够产生多种对人体有益的代谢产物，如胆固醇合成抑制剂、抗生素、麦角固醇和中药成分等。近年来，国内外学者对红曲霉产生的有效生理活性物质进行了更加深入的探索，发现更多具有营养保健及药用价值的代谢产物。本文对在金华市及其周边地区收集到的48种红曲米的生理特性进行研究，并对从红曲米中的红曲菌进行分离以得到菌株进行纯培养。然后用传统的形态学方法对分离得到的菌株进行观察并利用ITS-rDNA序列片段进行红曲霉菌种的鉴定。同时利用高效液相法来测定不同碳源、氮源对红曲发酵生产色素的影响。研究结果如下:
　　(1)在金华及周边地区收集到的48种红曲米研究发现，其外观、理化指标有明显的差距。不同红曲米样品中的含水量有所不同，其中样品QXYG含水量仅为2.36％，而红曲米DY6000、CK4、CZHQ等含水量均大于10％。此外，48种红曲米样品中只有样品QXZH中检出洛伐他汀，含量为16.30μg/g,但是所有红曲米样均检测出含有桔霉素。
　　(2)从采集到的不同红曲米中分离红曲菌，最终筛选得到红曲菌纯培养菌株30株。通过在MEA和CYA培养基上培养观察其菌落特征，同时在PDA培养基上培养后观察其显微特征。
　　(3)采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取红曲霉的DNA，利用ITS-rDNA序列片段进行扩展和测序，经GenBank数据库中Blast工具序列比对发现，红曲霉在ITS区的差异较小， ITS区基因序列分析的方法不足以分辨红曲菌到具体种，所以该方法适用于红曲菌属的鉴定，但是不适合用于属内种的鉴定。
　　(4)为了选出最为合适的红曲菌发酵生产红曲色素的培养基，在单因素实验的基础上，选取pH值、碳源、氮源三个主要因素进行L9(3)3正交实验，得到最佳发酵培养基组合为麦芽糖8％，硝酸铵0.0144 mol/L，pH值为4。

目录

摘要

1 文献综述

1．1 红曲米概述

1．2 红曲菌的代谢产物及其应用

1．2．1 红曲及红曲色素

1．2．2 红曲及桔霉素

1．2．3 红曲及洛伐他汀

1．2．4 红曲及γ-氨基丁酸

1．2．5 红曲及酶类物质

1．2．6 红曲的药用功效

1．3 红曲霉菌

1．3．1 红曲霉菌属的形态学及鉴定

1．3．2 红曲菌的分类

1．3．3 红曲菌的分子鉴定

1．4 本课题主要研究内容、目的及意义

2 金华及周边地区红曲米的分析研究

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验用红曲米的来源

2．1．2 主要药品

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 感官检测

2．2．2 水分测定：直接干燥法

2．2．3 色价的测定

2．2．4 洛伐他汀的测定

2．2．5 桔霉素定性分析

2．3 结果与分析

2．3．1 红曲米感官指标

2．3．2 红曲米中水分含量

2．3．3 红曲米中色素含量

2．3．4 红曲中洛伐他汀的含量

2．3．5 红曲中桔霉素的定性检测

2．4 讨论

3 红曲中红曲菌的分离

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料

3．1．2 主要药品及培养基

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 红曲霉的分离纯化

3．2．2 红曲霉菌落形态及显微特征

3．3 结果与分析

3．3．1 红曲菌的分离

3．3．2 红曲菌的菌落特征

3．3．3 显微特征

3．4 讨论

4 红曲中红曲茵的鉴定

4．1 材料与仪器

4．1．1 材料

4．1．2 主要药品及培养基

4．2 实验方法

4．2．1 红曲菌基因组DNA的提取

4．2．2 PCR反应体系及循环条件

4．2．3 ITS-PCR产物的胶回收

4．2．4 DNA测序

4．2．5 序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 PCR扩增产物的电泳检测

4．3．2 ITS区基因序列分析

4．4 讨论

5 不同碳源、氮源对红曲发酵产色素的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 化学试剂

5．1．3 实验仪器

5．1．4 主要培养基

5．2 实验方法

5．2．1 种子液制备

5．2．2 发酵培养

5．3 结果与分析

5．3．1 不同碳源对红曲霉产红曲色素的影响

5．3．2 不同氮源对红曲霉产红曲色素的影响

5．3．3 碳源与氮源的正交实验

5．3．4 验证试验

5．4 讨论

6 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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