乳酸菌发酵乳中抗氧化肽活性及序列结构的研究

摘要

氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。作为天然抗氧化剂的抗氧化肽一直是食品领域的研究热点。天然牛乳是优质蛋白质的重要来源，乳酸菌具有完备的蛋白水解酶系，利用乳酸菌发酵可以将牛乳中大分子蛋白质水解产生小分子活性多肽和氨基酸，既可以提高牛乳蛋白的吸收率又可以提高发酵乳的生物活性。本研究主要通过单独或者组合使用五株常见乳酸菌—保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosu）制备发酵乳，研究其中多肽的抗氧化活性和结构。 研究发现，复合菌种发酵乳中多肽的抗氧化活性均高于单一菌株发酵制备的多肽。其中五种乳酸菌混合发酵乳中的多肽提取物在体外抗氧化实验中DPPH自由基和ABTS自由基清除率高达51.30±0.69％和90.70±0.52％,金属离子还原能力和螯合能力分别为496.5μmol/L TE和94.22％，亚油酸氧化体系中其氧化抑制率高达85.84％，抗氧化能力综合评价最强。利用Caco-2细胞评价复合菌种发酵乳中所制备多肽的抗氧化能力，结果表明，所制备多肽提取物均可以在H2O2刺激下起到抗氧化作用，通过降低细胞内ROS水平从而降低氧化应激作用对细胞的损伤。利用五种乳酸菌混合发酵乳中的多肽提取物在细胞内抗氧化能力最强，其抗氧化能力与BHA、Trolox相当。 采用LC-MS/MS方法对复合发酵乳样品中的多肽序列结构进行分析，八种发酵乳样品中共鉴定到1601种多肽，其中八种复合菌种发酵乳共同拥有的多肽链为279条，其中有42种多肽与文献报道的抗氧化肽序列结构相同。LC-MS/MS丰度分析表明，42条多肽链在不同发酵乳中丰度不同，由L.bulgaricus，S.thermophilus，L.plantarum，L.rhamnosus和L.paracasei五种乳酸菌复合发酵乳中多肽含量最高，其抗氧化能力也最强。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1氧化应激与活性氧

1．1．1氧化应激与活性氧定义

1．1．2氧化应激的危害

1．2抗氧化防御

1．2．1酶类抗氧化物

1．2．2非酶类抗氧化物

1．3．1生物活性肽抗氧化性的研究进展

1．3．2乳源生物活性肽的抗氧化研究进展

1．4发酵乳中抗氧化肽的研究

1．4．1发酵乳中生物活性肽的产生

1．4．2发酵乳中生物活性肽的抗氧化研究

1．4．3抗氧化活力的研究方法

1．4．4抗氧化肽的抗氧化机理及其结构与活性的关系

1．5论文研究的目的、意义及内容

1．5．1论文的研究目的、意义

1．5．2论文的研究内容

2材料与方法

2．1．1材料与试剂

2．1．2实验设备及材料

2．2实验方法

2．2．1发酵乳的制备

2．2．2发酵乳pH、酸度及水解度的测定

2．2．3发酵乳中水溶性多肽的提取、含量测定以及氨基酸含量测定

2．2．4体外抗氧化性测定方法

2．2．5 Caco-2细胞培养和活性测定方法

2．2．6细胞内抗氧化性测

2．2．7发酵乳多肽的LC-MS／MS分析

2．2．8数据分析

3结果与讨论

3．1．1不同乳酸菌发酵对发酵乳pH及酸度影响

3．1．2不同乳酸菌发酵对发酵乳水解度的影响

3．2发酵乳中水溶性多肽的含量及氨基酸组分

3．2．1不同乳酸菌发酵乳中水溶’|生多肽含量比较

3．2．2不同乳酸菌发酵乳中多肽氨基酸组分比较

3．3不同乳酸菌发酵乳中多肽的体外抗氧化活性

3．3．1发酵乳多肽的DPPH和ABTS+·自由基清除能力比较

3．3．2发酵乳多肽的铁离子还原能力(FRAP)比较

3．3．3发酵乳多肽的螯合亚铁离子能力比较

3．3．4发酵乳多肽的抑制亚油酸过氧化能力

3．4复合乳酸菌发酵乳中多肽的细胞内抗氧化活性比较

3．4．1 Caco-2细胞的培养

3．4．2 BHA、Trolox以及复合菌发酵乳多肽的实验剂量筛选

3．4．3细胞诱导剂H2O2剂量筛选试验

3．4．4 H2O2诱导细胞内发酵乳多肽抗氧化能力比较

3．5基于LC-MS／MS对发酵乳多肽样品序列结构鉴定及其丰度

3．5．1复合菌发酵乳多肽样品中鉴定到的多肽种类和鉴定次数

3．5．2复合乳酸菌发酵乳多肽样品的相关性比较

3．5．3复合乳酸菌发酵乳中抗氧化肽序列结构

3．5．4复合乳酸菌发酵乳中抗氧化肽的丰度

4结论

4．1全文总结

4．2论文的创新点

4．3论文的不足之处

5 展望

参考文献

7攻读学位期间发表论文情况

致谢