山西老陈醋醋酸发酵阶段乳酸菌乳酸合成代谢分析

摘要

山西老陈醋是中国著名食醋，口感与风味独特，多采用固态发酵工艺，发酵过程中多种微生物参与，其中乳酸菌为主要优势菌群，也是乳酸的主要产生菌，对山西老陈醋风味的形成具有重要影响。然而，目前对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌代谢活性的认识仍不清晰，制约着食醋产业的发展。本论文利用分子生物学手段对食醋发酵过程中乳酸的代谢通路进行研究，并结合发酵条件变化对其中优势乳酸菌的乳酸合成代谢特征进行深入分析，解析山西老陈醋醋酸发酵过程中乳酸菌的乳酸合成代谢规律，有助于进一步理解食醋酿造机理，并为食醋工艺优化及过程控制提供理论依据。 对山西老陈醋醋酸发酵阶段的微生物演替及理化指标变化规律进行了分析，结果表明，乳酸菌是醋酸发酵阶段的主体微生物，其相对丰度占微生物的50％以上，利用典范对应分析的方法分析了乳酸菌菌群变化与主要理化指标之间的对应关系，发现乙醇，乙酸，温度和还原糖是影响乳酸菌演替的主要因素。其中，与乳酸和乙酸相关性较高的乳酸菌为Lactobacillus helveticus（瑞士乳杆菌）、Lactobacillus.fermentum（发酵乳杆菌）、Lactobacillus.acidophilus（嗜酸乳杆菌）和Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）。 利用PMA-qPCR技术建立了适用于食醋固态发酵过程中的乳酸菌活菌数快速定量检测的方法。确定PMA的最适用量为35μg/mL，曝光的最适时长为25min。分别针对同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和兼性乳酸发酵途径关键酶基因，即乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase complex，PDH)，丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase，POX)，乙酸激酶(acetate kinase，ACK)，进行固态发酵过程基因定量检测检测，结果表明该方法的精密度可以达到5％左右，加标回收率在90％-105％之间，表明该方法可以用来特异性检测混菌固态发酵体系中不同乳酸菌的活菌数。 对食醋醋酸发酵过程中乳酸菌的生长和产酸能力进行分析，结果显示发酵过程中L.plantarum AF1-1，L.fermentum AF4-5丰度最高，L.plantarum AF1-9，L.fermentum AF4-5为主要的产酸菌，L.fermentum AF4-5的活菌数与转录水平最高，L.plantarum AF1-9的平均转录水平最高，乙醇为发酵前期影响L.plantarum AF1-9的平均转录水平的主要因素，乙酸为发酵中后期影响L.fermentum AF4-5平均转录水平的主要因素。结合发酵过程中主要发酵条件的变化，即乙醇，乙酸，温度和葡萄糖的变化规律对乳酸菌的生长、产酸和产酸基因的转录水平进行分析，结果显示当固态培养基中乙醇浓度高于3g/100g醋醅，乙酸浓度高于1.5g/100g醋醅时，乳酸菌的生长和产酸也受到明显的抑制，且产酸关键基因在低浓度下转录水平高于高浓度下的转录水平;乳酸菌在发酵温度为37℃和45℃时的生长、产酸和产酸基因的转录水平均明显高于30℃时;乳酸菌在发酵底物（葡萄糖）浓度为2g/100g醋醅时的生长、产酸和产酸基因的转录水平明显高于1g/100g醋醅和3.5g/100g醋醅时。这些结果表明，发酵条件变化会影响乳酸菌产乳酸，控制生产过程中的发酵条件，可以控制发酵向有利于乳酸生产的方向进行，从而改进传统的发酵方式，改善食醋品质。

目录

声明

摘要

1前言

1．1传统食醋简介

1．1．1传统食醋发酵工艺简介

1．1．2山西老陈醋固态发酵工艺

1．2．1山西老陈醋发酵过程微生物群落组成

1．2．2山西老陈醋乳酸菌多样性与产酸功能分析

1．2．3食醋发酵过程对乳酸菌产乳酸的影响

1．3．1荧光定量PCR技术简介

1．3．2荧光定量PCR在发酵食品中的应用

1．3．3 PMA-qPCR方法简介

1．3．4 PMA-qPCR的应用

1．4立题依据与研究意义

1．5主要研究内容

2材料与方法

2．1实验材料

2．1．1实验菌种

2．1．2实验试剂

2．1．3培养基

2．1．4实验溶液

2．1．5主要实验仪器

2．2实验方法

2．2．1菌体培养方法

2．2．2醋醅总DNA的提取

2．2．3基因转录水平测定

2．2．4醋醅中活菌数的定量检测

2．2．5发酵过程乳酸菌代谢活性分析

2．2．6发酵条件对乳酸菌代谢的影响

2．2．7分析方法

3结果与讨论

3．1山西老陈醋醋酸发酵过程分析

3．1．1醋酸发酵过程理化指标变化规律分析

3．1．2醋酸发酵阶段微生物群落演替规律分析

3．1．3 CCA对应分析发酵过程中乳酸菌与理化指标之间的对应关系

3．2醋醅中活菌数定量检测方法的建立

3．2．1引物特异性验证

3．2．2PMA最佳处理条件的确定

3．2．3 qPCR标准曲线

3．2．4活菌定量检测方法的验证

3．3发酵条件对乳酸菌乳酸合成代谢活性的影响

3．3．1发酵过程中乳酸菌的生长和关键产酸基因表达变化

3．3．2乙醇对乳酸菌乳酸合成代谢的影响

3．3．3乙酸对乳酸菌乳酸合成代谢的影响

3．3．4温度对乳酸菌乳酸合成代谢的影响

3．3．5葡萄糖对乳酸菌乳酸合成代谢的影响

4结论

4．1全文总结

4．2论文的创新点

4．3论文的不足之处

5展望

参考文献

7攻读学位期间发表的论文及获奖情况

致谢