用于毒素检测的酶联免疫吸附测定(ELISA)研究

摘要

转基因蛋白Cry1Ab和黄曲霉毒素B1分别为最重要的转基因作物成份和致癌性最强、天然发生的真菌毒素，皆关乎民生。开发针对这两种毒素的快速检测方法对于日益高涨的农产品与食品安全检测、环境监测等需求有着十分重大的实用意义。本课题侧重于方法学上的创新，Cry1Ab蛋白和AFB1分别为典型的大分子和小分子抗原，依此对象建立的新方法也可以相对容易地推广到其它大分子和小分子分析物的检测；为拓展到致病菌、农药小分子等检测提供新的方法依据，服务于农业、食品、环境安全等。
　　 本课题综合利用光学、免疫学、农业与食品科学、材料科学、纳米技术、生物化学、有机化学和分析化学等诸多领域的知识，以大分子的内毒素(转基因蛋白Cry1Ab)和小分子的真菌毒素(黄曲霉毒素B1，AFB1)为对象，研究了用于毒素检测的酶联免疫吸附测定(ELISA)新方法。通过自制的纳米磁珠和商业化的核酸纯化系统，提升了免疫分析的自动化程度，建立了一种基于磁珠转运的半自动ELISA(Mts-ELISA)；将Mts-ELISA成功应用于转基因蛋白Cry1Ab的检测，为研发具有自主知识产权的高通量、自动化免疫分析仪器提供了方法依据。探索性地提出了ELISA检测的新方式一夹心竞争法和基于聚合HRP酶信号放大的间接竞争法，为开发新型的ELISA试剂盒和诊断试纸等提供了理论依据。
　　 主要研究结果和结论为：
　　 (1)以甲胎蛋白(AFP)为模型，建立了一种基于磁珠转运的半自动酶联免疫测定(ELISA)方法，并与基于酶标板的经典ELISA和基于磁珠的手动磁ELISA进行了比较。结果表明：通过水热法自制的磁珠粒径均匀，直径约440 nm，经硅层包裹和氨基化修饰后仍保有良好的磁响应能力；用戊二醛两步法链接的抗体和氨基化磁珠(20 mg/mL)的最优比例为20μg抗体/75μL磁珠；将商业化核酸纯化系统中的磁珠转运功能用于实现磁免疫分析的自动化是可行的，由此建立了一种灵敏的、基于磁珠转运的半自动ELISA(Mts-ELISA)；Mts-ELISA的灵敏度(0.104 OD·mL/ng)高于经典ELISA，且更加省时省力，检测时间为50 min，Mts-ELISA与手动磁ELISA灵敏度相当，但更省时省力，能实现高通量检测。
　　 (2)建立了Mts-ELISA检测转基因蛋白Cry1Ab。结果表明：水热法制备的440 nm磁珠具有顺磁性，饱和磁化率为56.8 emu g-1；将Mts-ELISA从以AFP蛋白为模型的直接夹心体系扩展到检测Cry1Ab蛋白的间接夹心体系是可行的；Mts-ELISA检测Cry1Ab的总时间不超过2h，能够检测出低至1 ng/mL的Cry1Ab蛋白，与商业化的Cry1Ab蛋白ELISA试剂盒检测性能相当。
　　 (3)提出了一种用于小分子检测的ELISA新方式一夹心竞争法，并与传统的直接竞争法进行了系统比较。结果表明：1)将AFB1蛋白偶联物(BSA-AFB1)当作一个整的大分子抗原，而把其上面连有的小分子AFB1当成这个新抗原大分子的新表位，使用相同的AFB1单克隆抗体对BSA-AFB1进行夹心检测是可行的；采用生物素标记的AFB1抗体来作为二抗时，该夹心法对BSA-AFB1的检测限为0.05 ppb。2)在夹心检测BSA-AFB1的基础上，引入自由的AFB1可以实现对BSA-AFB1信号的抑制，从而实现了对小分子AFB1的夹心竞争检测；3)对AFB1抗体进行生物素标记或酶标记作为二抗，都能实现夹心竞争法检测AFB1；采用酶标记抗体的夹心竞争法检测时间更短，所得校正曲线的背景噪声和变异系数小，优于采用生物素标记的抗体；4)经优化的夹心竞争法(第二批次的酶标记抗体，1:1000稀释；一抗浓度，2 ppm；夹心BSA-AFB1浓度，100 ppb)和直接竞争法(包被BSA-AFB1浓度，100 ppb；第二批次的酶标记抗体，1:1000稀释)在灵敏度、IC50和线性范围等性能上相当，夹心竞争法的IC50为0.06～0.07 ppb，检出限为19.4 ppt，线性范围为34.1～166.6 ppt；直接竞争法的IC50也为0.06～0.07 ppb，检出限为29.0 ppt，线性范围为40.2～135.8 ppt。5)夹心竞争法的组内(intra-assay)和组间(inter-assay)变异系数(CV)分别为4.9～19.3％和3.6～16.8%；直接竞争法的组内和组间变异系数(CV)分别为6.1～11.5%和4.2～9.9%。
　　 (4)引入了聚合辣根过氧化物酶(PolyHRP)作为信号分子进行信号放大，建立了基于生物素标记的黄曲霉毒素抗体(bioAb)和连有聚合HRP酶的链霉亲和素(Streptavidin-PolyHRP40，SA)的bioAb-SA间接竞争法，并和传统间接竞争法进行了系统比较。结果表明：1)bioAb-SA间接竞争法优化后的最优浓度组合为bioAb-SA(0.005-0.025 ppm)。2)传统竞争法中作为检测抗体(detection antibody，DeAb)的黄曲霉毒素单抗和作为示踪抗体(Tracer antibody，TrAb)的酶标记抗鼠IgG抗体的优化后最优浓度组合为DeAb-TrAb(0.005-0.2 ppm)。3)系统比较了两体系(bioAb-SA和DeAb-TrAb)最优浓度条件下检测不同基质中AFB1的性能参数。
　　 结果表明：bioAb-SA(0.005-0.025 ppm)体系下在PBS、MeOH/PBS和大麦基质中所得校正曲线的IC50分别为4.1 ppt、8，0 ppt和12.5 ppt，检测限LOD分别为0.7 ppt、1.3 ppt和0.8 ppt，其最大信号(0.D.)max分别为1.12、1.27和1.27；DeAb-TrAb(0.005-0.2 ppm)体系下在PBS、MeOH/PBS和大麦基质中所得校正曲线的IC50分别为4.2 ppt、4.4 ppt和6.8 ppt，检测限LOD分别为2.1 ppt、0.7 ppt和2.8 ppt，最大信号(0.D.)max分别为0.52、0.55和0.40。bioAb-SA和DeAb-TrAb体系下的IC50和LOD相当，但前者的灵敏度是后者的2～3倍；对比发现，Streptavidin-PolyHRP40的信号指示能力是同浓度酶标记抗鼠IgG抗体的16～20倍。