开菲尔乳杆菌醇脱氢酶的分子改造提高不对称合成(S)-CHOH的催化活性

摘要

(S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯((S)-CHOH）是他汀类药物合成的关键手性中间体。以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯(CDOH)为出发底物，经酶法不对称还原的合成路径是很有潜力的制备路线。目前存在的主要问题是具备催化活力的酶种类少且催化活性较低。本实验室前期改造来自Lactobacillus kefir DSM20587的醇脱氢酶LkADH获得的两点突变体MF147L-A202L具有较高的催化活性。本研究在此基础上继续对LkADH进行分子改造，以提高其催化活性，主要结果如下:
　　1)利用全质粒PCR方法对关键位点147和202进行定点饱和突变，获得多个酶活高于MF147L-A202L的突变体，其中MF147I-A202L酶活提高最为显著，比酶活为23 U/mg，较MF147L-A202L提高了27.8％。将酶活提高的突变体组合，但没有得到酶活高于突变体MF147I-A202L的组合突变体。
　　2)为了进一步提高MF147I-A202L的催化活性，利用同源建模和分子对接技术，根据LkADH的结构及催化机理，选择底物结合口袋附近的氨基酸残基(G145、L153、Y190、I144和G189)进行定点饱和突变，其中MF147PA202L-Y190F酶活提高最明显，比酶活为33 U/mg，较MF147I-A202L提高了43％。随后又利用丙氨酸扫描对底物结合口袋及底物通道处其他氨基酸进行虚拟突变，根据突变能高低选择5个位点突变为丙氨酸（M141A、 S96A、 L195A、V196A以及M206A），其中MF147I-A202L-S96A酶活提高最明显，比酶活为28 U/mg，较MF147I-A202L提高了21.7％。最后将MF147I-A202L-Y190F和MF1471-A202L-S96A组合得到了突变体MF147I-A202L-Y190F-S96A，其比酶活为44 U/mg，较MF147I-A202L提高了91％，较MF147L-A202L提高了144％。
　　3)建立了基于辅酶荧光强度变化的高通量筛选方法，通过易错PCR手段对MF147I-A202L定向进化，筛选获得一个酶活提高的突变体，经过测序发现突变子的190位点由酪氨酸突变为了苯丙氨酸，而该突变点也是半理性设计中找到的点，该结果证明定向进化方法具有较好的效果，但是还需要进行大量的突变和筛选才可能获得酶活更高的突变体。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 他汀类药物简介

1．2．3 以CDOH为底物合成(S)-CHOH的研究进展

1．3 醇脱氢酶概述

1．3．1 醇脱氢酶简介

1．3．2 醇脱氢酶的分类

1．3．3 SDR的结构

1．3．4 醇脱氢酶催化羰基不对称还原的机理

1．4 醇脱氢酶的分子改造

1．4．1 酶的定向进化

1．4．2 酶的理性设计

1．4．3 酶的半理性设计

1．4．4 LkADH和LbADH的分子改造研究

1．4．5 酶的商通量筛选模型的建立

1．5 本课题的研究思路和研究内容

第二章 醇脱氢酶MF147L-A202L的半理性设计

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种与质粒

2．2．2 主要实验仪器及设备

2．2．3 实验试剂与药品

2．2．4 溶液及培养基的配制

2．3 实验方法

2．3．1 菌种的保藏和活化

2．3．2 质粒的提取

2．3．3 DNA切胶回收

2．3．4 核酸琼脂糖凝胶电泳

2．3．5 定点突变引物设计

2．3．6 感受态细胞的制备

2．3．7 突变子的构建

2．3．8 突变酶的表达与纯化

2．3．9 不对称合成(S)-CHOH过程的酶活测定方法

2．3．1 0不对称合成(S)-CHOH过程的液相分析方法

2．3．1 1分子对接

2．3．1 2虚拟丙氨酸扫描

2．3．1 3蛋白质浓度的测定

2．3．1 4动力学参数测定

2．4 结果与讨论

2．4．1 关键位点147、202的饱和突变

2．4．2 醇脱氢酶MF147I-A202L的同源蹙模

2．4．3 醇脱氢晦MF147I-A202L与底物CDOH的分子对接

2．4．4 基于催化活性口袋的半理性设计

2．4．5 虚拟突变

2．4．6 突变点的组合

2．4．7 突变体的动力学分析

2．4．8 突变位点的作用机理解析

2．5 本章小结

第三章 醇脱氢酶MF147I-A202L的定向进化

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种与质粒

3．2．2 主要实验仪器及设备

3．2．3 实验试剂与药品

3．2．4 溶液及培养基的配制

3．3 实验方法

3．3．1 高通量傩选方法的建立

3．3．2 易错PCR条件的确定

3．3．3 双酶切、酶连及PCR产物回收

3．3．4 高通量筛选过程

3．3．5 文库突变率的测定

3．3．6 突变子的复筛

3．4 结果与讨论

3．4．1 商通量筛选方法的建立

3．4．2 突变文库的建立

3．4．3 定向进化的结果

3．5 本章小结

第四章 MF147I-A202L-Y190F-S96A酶学性质研究及产酶条件优化

4．1 引言

4．2 实验材料与设备

4．2．1 菌种与质粒

4．2．2 主要实验仪器与设备

4．2．3 实验试剂与药品

4．2．4 溶液及培养基的配制

4．3 实验方法

4．3．2 醇脱氢酶MF147I-A202L-Y190F-S96A产酶条件的优化

4．4 结果与讨论

4．4．1 酶学性质

4．4．2 产酶条件优化

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

作者简介