基于RNA的PCR技术对食品中沙门氏菌与金黄葡萄球菌的检测

摘要

食品微生物是影响食品安全的重要因素，由食源性致病菌引起的病例越来越多。致病菌往往共存于复杂的生物体系中，且个体微小、致病性高，因此，微生物检测方法必须要高灵敏度、强特异性以及较短的分析时间。传统的培养法，需要3~7天的时间，操作繁琐，所用试剂复杂多样，无法对微生物进行实时而有效的监测和防控；而基于DNA水平的普通聚合酶链式反应（PCR）检测技术，虽然具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点，但却无法区分死、活细菌，使得检测结果与现行的致病菌检测标准不一致，故普通PCR法只能用来对已经分离培养的致病菌进行快速鉴定，而不能对样品中的致病菌进行直接检测。因此，建立一套快速、灵敏又能区分死、活菌的检测方法，尤为重要。
　　本研究选取食品中代表性的致病菌，即革兰阴性沙门菌(Salmonella)和革兰阳性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分别以沙门氏菌invAmRNA与金黄色葡萄球菌femA mRNA为检测对象，建立了一套Taqman探针一步实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法，主要有以下结论：
　　1)该一步RT-PCR测法，活菌的检测结果显阳性，死菌的检测结果呈现阴性，能够有效的区分死、活菌；
　　是否为阳性样本还可采用以下方法判定：
　　若同一样本RT-PCR的扩增Ct值与PCR的扩增Ct值相差大于等于4，则该样本为阳性；若二者的Ct差值小于4，那么使用DNaseI再消化一次，如果再次消化后，二者的Ct差值大于等于4，那么该样本为阳性，反之则为阴性；
　　2)菌液在4℃的环境保存时，细菌的代谢活性会减弱，mRNA的表达量会下降，在进行RT-PCR检测时，应预先活化菌液；最佳增菌方式为：50μL菌液添加到3mLLB液体培养基中，200rpm、37℃震荡培养3h；
　　3)离心柱式试剂盒法所提取的RNA能够用于RT-PCR对活菌的检测，而传统TrizolRNA提取法所提取的RNA不适用于RT-PCR对活菌的检测；
　　4)一步法与两步法RT-PCR在检测结果的Ct值上，没有较为明显的差异，但一步法耗时短，易于操作，检测成本低，更适合于食源性致病菌的快速检测；
　　5)DNA会干扰RT-PCR对mRNA的检测，RT-PCR检测时，需使用DNaseI除去RNA抽提液中残留的DNA，才能有效的区分死、活菌；两次DNaseI的使用几乎能去除所有的残留DNA，是否需再次使用DNaseI的判定方法：在经RT-PCR扩增后，活菌与死菌的Ct值相差大于等于4时，可认为两者的Ct值存在差异，可再次使用DNaseI消化提取液；否则，重新实验；
　　6)探针、引物是影响RT-PCR检测的重要因素，将直接影响RT-PCR的定量结果；本文自设计的femA引物、探针具有高度的特异性，其RT-PCR扩增产物序列与金黄色葡萄球菌femA基因序列同源，相似性达100％；在DNA定量的准确性上已经接近市售标准试剂盒水平，在灵敏度上已高于市售试剂盒；该引物、探针可用于普通试剂盒的生产；
　　7)该一步RT-PCR检测法稳定性良好，能够检测到处于VBNC状态下的沙门氏菌，具有较强区分死、活菌的能力；在检出限、灵敏度上均优于现行国家商检标准；沙门氏菌：灵敏度为4×103CFU/mL，检出限可达1CFU/3mL；最佳扩增参数为：45℃×10min；95℃×15min；94℃×20s，60℃×20s，72℃×20s，40cycles；单点荧光在72℃；选用FAM通道检测；金黄色葡萄球菌：灵敏度为9×102CFU/mL，检出限可达1/3CFU/3mL；最佳扩增参数为：45℃×10min；95℃×15min；94℃×20s，55℃×20s，72℃×30s，40cycles；单点荧光在72℃；选用FAM通道检测。
　　本论文所建立的一步实时RT-PCR检测法快速、灵敏、特异性强，而且能够准确的定量活菌，随着研究的深入，该检测法可推广应用到其它致病菌的检测中，建立一种能够同时食品中检测多种致病菌的多重实时RT-PCR。

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前 言

第一章 文献综述

1.1 食源性致病菌的危害

1.2 食品微生物检测的意义

1.3 食源性致病菌检测现状及分析

1.4 实时荧光定量PCR技术

1.5 研究的背景意义

1.6 研究与开发内容

1.7 技术指标

1.8 技术路线

第二章 沙门氏菌的检测

2.1 材料与方法

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 金黄色葡萄球菌检测

3.1 材料与方法

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 讨论

4.1细菌的VBNC检测

4.2 EMA-RT-PCR检测法

第五章 结论

第六章 创新点及展望

6.1 创新点

6.2 展望

参考文献

致谢

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