miR-21小分子抑制剂的筛选及肿瘤靶向治疗的实验研究

摘要

近年来，微RNA(microRNAs，miRNAs)作为进化保守的一类非编码RNAs在调控基因表达的功能上引起了人们的极大关注。MiRNAs的长度大约为19-25个核苷酸序列，它通过与靶点mRNA结合抑制其翻译或启动降解来发挥作用。目前在人类基因组织中已发现超过1000种miRNAs，它们的异常表达在包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病发生及进展中发挥重要作用，并且miRNA的测序分析结果揭示其表达特征可以作为某些恶性肿瘤的分子标签，对指导恶性肿瘤的分级，诊断，预后及治疗具有重大意义。因而探索典型的差异表达的miRNAs，确定其与恶性肿瘤的相关性，寻求抑制其活性的高效靶向药物，是极具潜力的肿瘤治疗策略。
　　MiR-21是人类基因组中最早发现的与癌症相关的微RNA，在脑胶质母细胞瘤，乳腺癌，胃癌，结肠癌，肺癌等多种肿瘤中存在高表达，并通过作用于多个靶点参与了多条与肿瘤发生，进展，转移，治疗耐受相关的信号通路。目前针对miRNAs干扰应用较多的是非小分子的核苷酸类制剂，但由于投递效率较低且药效学及药代学特性的缺陷限制了其临床应用，因而研发miR-21高效的天然小分子抑制剂将为肿瘤的靶向治疗指明新的方向。
　　本课题第一部分我们通过利用3D结构模拟计算机辅助药物设计的方法构建出了pre-miR-21茎环部位的3D结构，并与美国癌症研究所小分子数据库中的化合物进行分子对接，从而获得候选小分子化合物。接着对候选化合物进行体外miR-21抑制效果检测，确定了具有潜力的miR-21小分子抑制剂AC1MMYR2。AC1MMYR2对miR-21的抑制效果具有浓度依赖性及时间依赖性并可以上调miR-21功能性靶点PTEN，PDCD4及RECK的表达水平，并在作用6h时，对miR-21的抑制具有较好的特异性，而在作用24h时，miR-200a/b，miR-218，miR-1280等miRNAs表达出现了不同程度的上调。此外，与miR-21低表达的肿瘤细胞相比，AC1MMYR2对miR-21高表达状态的肿瘤细胞具有更强的抑制效果。
　　在本课题第二部分中我们发现AC1MMYR2在抑制mature miR-21表达水平的同时，抑制了pri-miR-21的表达水平与STAT3的转录活性，而pre-miR-21的表达水平却被上调。进一步的研究证明AC1MMYR2在pre-miR-21生成maturemiR-21的过程中发挥作用，它通过与Dicer竞争性结合pre-miR-21茎环结合位点，抑制了pre-miR-21剪切生成mature miR-21。而STAT3被报道可以与miR-21编码基因的启动子上游结合促进miR-21的转录。因而，我们推测存在AC1MMYR2-STAT3-pri-miR-21的反馈环路，这在一定程度上对AC1MMYR2下调pri-miR-21的机制作出了解释。同时，AC1MMYR2对于Dicer结合位点的作用具有特异性，将pre-miR-21茎环部位的Dicer结合位点进行点突变之后，突变体的3D结构与AC1MMYR2结合力减弱，AC1MMYR2的活性降低。此外，AC1MMYR2发挥miR-21抑制作用依赖于Dicer的表达水平，当Dicer表达水平较低时，限制了AC1MMYR2对miR-21的抑制作用。
　　本课题第三部分我们重点探讨了AC1MMYR2抑制miR-21表达水平后，对5种上皮性肿瘤细胞恶性生物学行为的影响。AC1MMYR2可降低肿瘤细胞的克隆形成率，并将细胞周期阻滞在G0/G1期从而抑制了肿瘤细胞的增殖能力;同时AC1MMYR2促进了肿瘤细胞的凋亡率及Caspase3/7活性并抑制了其侵袭和迁移能力。此外，AC1MMYR2处理后的细胞上皮性标志物E-cadherin表达水平升高，而间质性标志物N-cadherin，β-catenin，ZEB1，ZEB2，MMP9的表达水平降低，这表明AC1MMYR2在某种程度上可以逆转肿瘤细胞的上皮间质转化。在AC1MMYR2处理6h后的U87细胞测序结果中发现，534个差异表达基因显著富集于癌症相关通路及TGF-β通路（在14条具有统计学意义的信号通路中排前2位），这在一定程度上揭示了作为miR-21的小分子抑制剂AC1MMYR2作用效果与肿瘤及EMT过程密切相关。
　　本课题第四部分通过构建U87胶质瘤颅内模型及MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌原位模型对AC1MMYR2的药效在体内做了进一步的验证。AC1MMYR2显著抑制了肿瘤生长速度，改善了颅内荷瘤小鼠的生存预后，并抑制了乳腺癌肿瘤细胞向肺内的转移。同时，我们还在治疗结束后对U87胶质瘤颅内模型的小鼠重要内脏组织进行了H&E染色，AC1MMYR2治疗组对肝、肾等器官并未引起肉眼看见的形态变化。此外，我们对非特异性miR-21小分子抑制剂BASI(NSC-211332)的U87颅内实验表明，BASI可以抑制颅内肿瘤的生长，并改善了小鼠的生存预后，而这一过程是通过改变一系列β-catenin相关的miRNAs(miR-21，miR-23b，miR-200a, miR-181d)间接抑制Wnt/β-catenin信号通路实现的。
　　综上所述，在本研究中我们通过利用计算机辅助设计及高通量筛选的方法确定了一种高效且特异性的miR-21小分子抑制剂-AC1MMYR2。它不仅可以通过上调miR-21功能性靶点PTEN、PDCD4及RECK的表达水平，而且还可以通过上调miR-200a/b和miR-181d的表达水平逆转上皮间质转化过程来发挥显著的抗肿瘤效果。总之，我们的研究表明AC1MMYR2是一种有效的且对正常脏器无毒性作用的小分子抑制剂，对于人类上皮性肿瘤具有潜在的临床应用价值。
　　AC1MMYR2通过阻断Dicer剪切pre-miR-21来抑制miR-21的生成水平，并通过上调靶点PTEN，PDCD4、RECK的表达水平及逆转EMT发挥抗肿瘤效果

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、miR-21小分子抑制剂的筛选及AC1MMYR2的特异性验证

1．1 对象和方法

1．1．1 对象

1．1．2 方法

1．1．3 统计学处理

1．2 结果

1．2．1 候选小分子化合物AC1MMYR2的确定

1．2．2 不同AC1MMYR2浓度及处理时间对miR-21表达水平的影响

1．2．3 AC1MMYR2对miR-21功能性靶点的作用

1．2．4 AC1MMYR2对其他11种miRNAs表达水平的影响

1．2．5 AC1MMYR2对不同miR-21表达水平的肿瘤细胞的影响

1．3 讨论

1．4 小结

二、AC1MMYR2阻断mature miR-21的生成过程并依赖于Dicer酶的表达水平

2．1 对象和方法

2．1．1 对象

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．1 AC1MMYR2对pri-miR-21及pre-miR-21表达水平的影响

2．2．2 AC1MMYR2作用位点的特异性验证

2．2．3 AC1MMYR2对STAT3转录活性的影响

2．2．4 AC1MMYR2作用效果与Dicer表达水平关系的探讨

2．3 讨论

2．4 小结

三、AC1MMYR2逆转上皮间质转化抑制肿瘤细胞生物学行为的研究

3．1 对象和方法

3．1．1 对象

3．1．2 方法

3．1．3 统计学处理

3．2 结果

3．2．1 原位杂交检测AC1MMYR2处理后miR-21的表达水平

3．2．2 AC1MMYR2对肿瘤细胞增殖的影响

3．2．3 AC1MMYR2对肿瘤细胞凋亡的影响

3．2．4 AC1MMYR2对肿瘤细胞迁移的影响

3．2．5 AC1MMYR2对肿瘤细胞EMT标志物的影响

3．2．6 生物信息学方法分析AC1MMYR2的生物功能

3．3 讨论

3．4 小结

四、AC1MMYR2抑制肿瘤细胞生长、侵袭作用的体内研究

4．1 对象和方法

4．1．1 对象

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 裸鼠U87胶质瘤颅内模型的治疗效果评价

4．2．2 裸鼠MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌原位模型的治疗效果评价

4．2．3 裸鼠乳腺癌原位模型肺转移情况检测

4．2．2 治疗后肿瘤细胞恶性表型相关指标的变化

4．2．3 治疗后重要脏器的形态学观察

4．2．4 非特异性miR21小分子抑制剂BASI的治疗效果评价

4．3 讨论

4．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

靶向miRNA在胶质母细胞瘤治疗中的研究进展

致谢