负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究

摘要

【目的】
　　研究结肠癌干细胞来源的gp96-肽复合物冲击树突细胞（DC）后，与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养，探讨其对结肠癌干细胞的杀伤效果。为进一步研究奠定基础。
　　【内容】
　　论文首先采用3种方法检测常规培养的结肠癌细胞HT29中是否存在肿瘤干细胞（CSC），三种方法分别是：双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29细胞中侧群细胞（SP）的比例，流式细胞仪分析HT29贴壁细胞中CD133＋细胞的比例，应用Western blotting检测其ALDH1蛋白表达情况；确认存在CSC后利用无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌干细胞，并于显微镜下观察其成球状况及形态学特征；利用流式仪（检测 HT29微球中 CD133+细胞比例）、Western blotting（检测ALDH1蛋白表达情况）及克隆形成试验对HT29结肠癌干细胞的富集效果进行检测，并进行统计学分析。继而，从HT29微球中提取细胞总蛋白后，通过硫酸铵分级盐析，经ConA亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物备用；从脐血中分离单个核细胞，分别培养DC和CIK，用纯化的gp96-肽复合物冲击DC，与CIK共培养，采用LDH法检测gp96-肽复合物冲击DC-CIK细胞对结肠癌CSC的杀伤活性，其结果用统计学方法分析。
　　【方法】
　　1.用双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养 HT29细胞中侧群细胞的比例，利用流式、Western blotting分别检测HT29贴壁细胞CD133＋细胞的比例及ALDH1蛋白表达情况。
　　2.使用添加多种因子的无血清培养基富集HT29结肠癌干细胞，显微镜下观察微球规则后，胰酶消化，制备单细胞悬液进行传代。
　　3. HT29结肠癌干细胞富集效果的检测：采用流式细胞术检测 HT29微球中CD133的表达，Western blotting检测HT29微球中ALDH1的表达；克隆形成试验检测HT29微球的克隆形成能力。
　　4.将从结肠癌细胞HT29微球中提取的总蛋白通过硫酸铵分级盐析后，经ConA亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物，并通过SDS-PAGE、蛋白免疫印迹对其进行鉴定，利用BCA法测定各步所得蛋白的浓度。
　　5.从脐血分离单个核细胞后，分别培养 DC、CIK，DC培养至第5天加入纯化的gp96-肽复合物，继续培养72h，促进DC成熟。于培养第10天将DC、CIK以1:5的比例混合培养，继续培养2-3天后采用 LDH法检测对结肠癌CSC的杀伤活性。
　　【结果】
　　1.利用 Hoechst33342荧光染料检测 HT29细胞中 SP细胞的含量为3.45％±0.05%，此外，流式细胞仪分析常规培养的HT29中 CD133＋细胞的比例为45.38%±10.65%；Western blotting结果显示，HT29贴壁细胞ALDH1蛋白表达阳性。采用3种方法检测常规培养的HT29贴壁细胞，均表明其存在肿瘤干细胞亚群。
　　2.无血清悬浮培养7-10d，可形成规则的HT29微球，且状态最佳；血清可以促进HT29微球的分化；此外，HT29微球可在含血清培养基（SSM）和无血清培养基（SFM）中交替转化。
　　3. HT29结肠癌干细胞富集效果的检测显示：HT29微球中CD133＋细胞的比例高于常规培养的HT29细胞中 CD133＋的细胞比例（P＜0.05），HT29微球中ALDH1蛋白表达量与常规培养的HT29细胞相比明显提高（P＜0.05），HT29微球的克隆形成率较HT29细胞明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01)。
　　4.经SDS-PAGE、蛋白免疫印迹鉴定从HT29微球中提取、纯化出的蛋白为gp96-肽复合物。1g湿重的HT29微球经纯化后可得到纯度95%的gp96-肽复合物40μg左右。
　　5.负载gp96-肽复合物的DC与CIK共培养后，当效靶比为40:1时，对HT29结肠癌CSC的杀伤效果明显，杀伤率[(33.07±2.79)%]要高于DC+CIK组[(15.20±1.67)%]（P＜0.05）。
　　【结论】
　　1.悬浮培养法可用于富集HT29结肠癌干细胞，且便于操作，适于实验研究。
　　2.通过硫酸铵盐析、ConA亲和层析、DEAE离子交换层析从HT29微球中成功纯化出gp96-肽复合物。
　　3.负载gp96-肽复合物的DC-CIK可以有效地杀伤结肠癌干细胞，为肿瘤干细胞新策略的研究奠定了实验基础。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、悬浮培养法富集结肠癌CSC

1.1对象和方法

1.1.1 材料

1.1.2 主要溶液的配制

1.1.3实验方法

1.1.4统计学分析

1.2结果

1.2.1常规培养HT29结肠癌细胞中CSC的检测

1.2.2 悬浮培养法富集HT29结肠癌CSC

1.2.3 HT29结肠癌CSC富集效果的检测

1.3讨论

1.3.1 分选、富集肿瘤干细胞技术的选择

1.3.2 无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌CSC实验总结

1.4小结

二、负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源CSC杀伤作用的初步研究

2.1对象和方法

2.1.1 材料

2.1.2 主要溶液的配置

2.1.3实验方法

2.1.4 统计学处理

2.2实验结果

2.2.1 HT29微球中gp96-肽复合物的提取、纯化及鉴定结果

2.2.2 gp96-肽复合物诱导DC-CIK杀伤HT29结肠癌CSC结果

2.3讨论

2.3.1 gp96-肽复合物的提取与纯化

2.3.2 负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源CSC杀伤实验效果总结

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:热休克蛋白96抗肿瘤免疫的研究进展

致谢