克雷伯属和变形杆菌属16S-23SrRNA基因间区分析及奶粉中重要要致病菌检测基因芯片的研制

摘要

本文对克雷伯氏菌属和变形杆菌属的重要菌种的16S-23S rRNA基因间区(16S-23S rRNA internal transcribed spacer,简称ITS)进行了测序和分析,为利用ITS基因簇中的变异区进行菌种鉴定奠定了基础。本文还研制了奶粉中重要致病菌检测基因芯片,基于ITS和O抗原基因设计和筛选了探针,正是ITS序列破译和分析工作的延伸。
　　 克雷伯氏菌属和变形杆菌属的某些种是重要的人类致病菌,能引起多种疾病,危害严重。与此同时,多重耐药菌株的出现近年来持续增加,因此急需积累这些菌的相关资料,为预防和控制这些病原菌提供技术支持。然而,克雷伯属和变形杆菌属的属内不同种间差别不大,现有的鉴定手段不易区分。近年来,ITS因具有更高的分辨率,对于亲缘关系较近的种属的区分比16S rRNA和23SrRNA更具优势。然而ITS数据资源少,满足不了序列分析特异性的需要。因此我们破译并分析了克雷伯氏菌属和变形杆菌属的间区,探讨其可否应用于菌种的检测和鉴定。
　　 本研究完成了21株克雷伯属菌株的ITS序列破译,最终得到了336条ITS序列。克雷伯氏菌属的肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌、解鸟氨酸克雷伯氏菌均含有三种间区类型:ITSnone,ITSglu和ITSile+ala;而鼻硬结克雷伯氏菌只含有两种间区类型:ITSglu和ITSile+ala。这是目前所知的,在肠杆菌科中只有克雷伯属有ITSnone类型的间区。克雷伯属ITS序列种内是高度保守的,ITSnone间区的种内序列相似性是0.961-1.000,ITSglu间区的种内序列相似性是0.967-1.000,ITSile+ala间区的种内序列相似性是0.968-1.000。克雷伯属种间序列相似性比16s rDNA序列相似性要低,ITSnone是0.775-0.989,ITSglu是0.798-0.997,ITSile+ala是0.712-0.985。在ITSnone序列中,有2个变异区;在ITSglu中有5个变异区;在ITSile+ala中有6个变异区。这些变异区主要位于tRNA基因和23S rRNA基因之间和两个tRNA基因之间。进化分析表明,基于ITS构建的进化树与基于16S rRNA基因构建的进化树很相似。此外,我们还基于ITS设计并筛选得到了特异性扩增和检测肺炎克雷伯氏菌和臭鼻克雷伯氏菌。
　　 同样的,我们破译了46株变形杆菌的831条ITS序列,分析表明变形杆菌属有两种ITS类型:ITSglu和ITSile+ala。根据ITS类型和长度,可将变行杆菌ITS序列分为28个变体,根据碱基序列相似性,这28个变体是25个不同的基因起源。ITS序列种内高度保守,序列相似性高达96.2-100％。所有ITS序列可划分为三个保守区和两个变异区,保守区和变异区镶嵌排列,构成了“马赛克”状ITS序列结构。基于变形杆菌ITS的第二个变异区(v2)构建的进化树比16SrDNA序列构建的进化树可将潘氏变形杆菌同普通变形杆菌分的更开。在ITSglu的变异区设计的特异引物,可特异的将奇异变形杆菌与其他临床上常见的普通变形杆菌、潘氏变形杆菌、产粘变形杆菌等区分开。
　　 本文分析了克雷伯属和变形杆菌属的ITS序列,确定了保守区和变异区,为基于ITS对菌种进行检测和鉴定奠定了基础。
　　 基因芯片是一种可以对核酸分子进行平行和高通量检测的技术,本文以奶粉中常见的坂崎肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、鲍曼不动杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157计10种致病菌为检测对象研制了病原菌检测用基因芯片。利用ITS序列和大肠杆菌O157的O抗原基因簇中的特异基因wzy设计引物和探针对这些菌种进行检测和鉴定。样品经过两步法前处理后,用裂解液提取基因组,用作PCR模板DNA,然后只加入下游引物进行扩增和标记,标记产物与芯片杂交。总计用185株菌(134个检测范围内的菌株和51个其他种菌株)进行了芯片性能评价,筛选得到了27条特异检测。完成了芯片的特异性、灵敏度、多样品检测和双盲实验,并完成了21例实际奶粉样品检测,结果显示该芯片具有良好的特异性、灵敏度和实用性。可广泛应用于微生物基础研究、临床检测、食品安全和流行病学调查等领域,具有良好的应用前景。