金地灵芝液态发酵产灵芝多糖条件优化及其发酵产物功能的研究

摘要

灵芝是我国具有悠久历史的名贵中药，是一种药食两用大型真菌。其中含有多种生物活性成分，以灵芝多糖为代表，能够治疗高血压、冠心病、肝炎、哮喘等疾病，在医疗、保健、工业生产中都有极大意义与价值。磷脂酶D是一类具有水解和转磷脂活性的磷脂酰胆碱酶，存在于动植物及微生物体内，主要被应用于磷脂改性及稀有磷脂制备，是一种具极大应用价值的酶。利用微生物液态发酵生产磷脂酶D，与从动植物体内分离磷脂酶D相比，具有生长周期短、易分离提取、酶活高等优势。
　　本试验选择引自日本的金地灵芝，介于四川地理环境及气候条件与日本的差异性，故需对其培养条件进行重新探究。
　　试验以金地灵芝为试材，以发酵液中灵芝多糖含量为优化指标，运用单因素及响应面分析法，对液态发酵的培养基及培养条件进行优化;在最优条件下，采用水提醇沉提取称干重，探究发酵过程中灵芝多糖含量随时间的变化，通过铁氰化钾还原试验和DPPH自由基清除试验探究发酵液抗氧化活性随时间的变化，分析发酵液抗氧化活性与发酵液中灵芝多糖含量的关系;采用微量肉汤稀释法，探究灵芝多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、白色念珠菌的抑菌效果;利用发酵液催化卵磷脂与丝氨酸反应，通过TLC、HPLC双重定性检测反应产物中磷脂酰丝氨酸含量，探究金地灵芝产具转磷脂活性的磷脂酶D的能力。研究结果如下:
　　1)结合多糖含量及成本考虑，最优培养基配方为:3.98％玉米粉、0.68％蛋白胨、0.21％ MgSO4·7H2O、0.05％ K2HPO4、0.05％ KH2PO4、0.001％维生素B1，优化后多糖含量为1.917 g/100mL，比初始培养基时提高了50.8％;最佳培养条件为:温度27℃、pH=6、转速150 rpm、接种量10％、发酵时间5d，优化后多糖含量为2.857 g/100mL，比初始条件下提高了49.5％。
　　2)在连续发酵过程中，发酵5d时灵芝多糖含量达到最大，为2.852 g/100mL;7d时发酵液还原力达最强，吸光值为0.520;8d时发酵液DPPH清除率达最高，80.7％;发酵液抗氧化活性与灵芝多糖含量正相关性极显著。
　　3)灵芝多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、白色念珠菌的抑菌率均可达到100％，其MIC值分别为80 mg/mL、120 mg/mL、60 mg/mL、100 mg/mL、140 mg/mL。
　　4)经TLC、HPLC双重定性检测，结果显示反应产物中含有一定量的磷脂酰丝氨酸，表明金地灵芝具有产磷脂酶D的能力。
　　上述研究表明，金地灵芝生长周期短，多糖产率高，其发酵产物抗氧化活性强、抑菌效果好，且发酵产物中所含的磷脂酶D是目前国内鲜有报道的真菌源磷脂酶D，基于灵芝的药食两用性，此磷脂酶D在医疗保健品生产工业中有更高安全性。综上，金地灵芝在工业发酵、医疗保健品生产方面具有极高应用价值。

目录

声明

摘要

图表清单

1 引言

1．1 灵芝

1．1．1 灵芝的生物学特性

1．1．2 灵芝的主要化学成分

1．1．3 灵芝液态发酵的研究进展

1．2 灵芝多糖

1．2．1 灵芝多糖的结构与成分

1．2．2 灵芝多糖的提取及纯化方法

1．2．3 灵芝多糖的药理活性及其应用

1．3 磷脂酶D

1．3．1 磷脂酶D的来源

1．3．2 磷脂酶D的分离纯化方法

1．3．3 磷脂酶D的功能及应用

1．4 本课题主要研究内容

参考文献

2 金地灵芝液态发酵产胞外多糖的营养条件优化

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．1．3 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 不同浓度碳源对金地灵芝液态发酵的影响

2．2．2 不同氮源对灵芝产胞外粗多糖的影响

2．2．3 无机盐对灵芝产胞外粗多糖的影响

2．2．4 响应面分析(RSA)试验优化发酵培养基

2．3 结论

参考文献

3 金地灵芝液态发酵产胞外多糖的培养条件优化

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 不同培养温度对灵芝发酵产胞外粗多糖的影响

3．2．2 不同pH对灵芝发酵产胞外粗多糖的影响

3．2．3 不同转速对灵芝产胞外粗多糖的影响

3．2．4 不同接种量对灵芝发酵产胞外粗多糖的影响

3．2．5 发酵时间长短对灵芝发酵产胞外粗多糖的影响

3．2．6 响应面分析(RSA)实验优化发酵培养基时间

3．3 结论

参考文献

4 发酵过程中多糖含量及发酵液抗氧化活性的变化

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 灵芝多糖的产量随发酵时间的变化

4．2．2 不同发酵时间的发酵液的还原力变化趋势

4．2．3 金地灵芝发酵液对DPPH自由基的清除能力

4．2．4 多糖含量与发酵液还原力的相关性

4．2．5 金地灵芝发酵液对DPPH自由基的清除能力

4．3 结论

参考文献

5 灵芝多糖的抑菌活性探究

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 灵芝多糖的抑菌活性

5．3 结论

参考文献

6 金地灵芝产磷脂酶D活性研究

6．1 材料与方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 试验方法

6．2 结果与分析

6．2．1 TLC定性检测分析

6．2．2 HPLC定性检测分析

6．3 结论

参考文献

7 结论与展望

致谢

在校期间科研成果